沙 紅，高 燕，董心久，高衛(wèi)時(shí)，瑪依拉·玉素音，楊洪澤

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】甜菜(Beta.vulgarisL.)屬于藜科(Chenopodiaceae)甜菜屬(BetaL.)，2年生經(jīng)濟(jì)作物，是我國北方重要的產(chǎn)糖原料[1]。我國甜菜種質(zhì)多樣，主要有糖用、飼用、直接食用。糖用甜菜栽培品種多為在二倍體或四倍體，在育種過程中也會(huì)出現(xiàn)單倍體、三倍體，但是甜菜多倍體品種較二倍體品種具有更強(qiáng)的雜種優(yōu)勢。目前，我國糖用甜菜已進(jìn)入廣泛應(yīng)用多倍體雜種優(yōu)勢階段，生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的品種以三倍體雜交種為主[2]。在利用手中資源選育品種時(shí)，及時(shí)、準(zhǔn)確了解掌握材料的倍性，有利于加快選育進(jìn)程、提高選育目標(biāo)性。流式細(xì)胞術(shù)(flow, cytometry, FCM)是一種能夠?qū)θ后w細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞水平的多個(gè)參數(shù)同時(shí)快速定量分析和分選的技術(shù)，其在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用還有較大的發(fā)展空間[3]。流式細(xì)胞技術(shù)可以精準(zhǔn)地對(duì)鞘液中的熒光微粒進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，快速、準(zhǔn)確、簡便地檢測待測植物的倍性與細(xì)胞核DNA含量，并且非常適用于大樣本的檢測分析，是近年用來檢測染色體倍性的常用方法[4-6]。倍性水平的分析、鑒定對(duì)于植物分類及育種具有重要意義[5]。研究流式細(xì)胞術(shù)檢測甜菜染色體倍性和DNAC-值，對(duì)甜菜染色體倍性、分子生物學(xué)領(lǐng)域相關(guān)研究有實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】傳統(tǒng)的倍性鑒定多采用根尖、莖尖或花粉粒直接進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)來判斷倍性，傳統(tǒng)染色體倍性鑒定技術(shù)需要專業(yè)技術(shù)人員具有相當(dāng)熟練的操作技能，過程復(fù)雜，耗時(shí)多[7，8]。李盛賢[9]在1988年報(bào)道過以掃描顯微光密度測定法對(duì)甜菜植株和種子有生殖力的多倍性進(jìn)行測定。董立[10]研究了甜菜染色體鏡檢的具體方法。魯文英[11]、魏良民[12]等利用甜菜葉片保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體個(gè)數(shù)或觀察氣孔性狀來判斷甜菜的倍性。但用甜菜葉片保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體個(gè)數(shù)或觀察氣孔性狀鑒定在糖用甜菜、飼用甜菜表現(xiàn)不一樣，判斷二倍體、四倍體的標(biāo)準(zhǔn)也不同，在材料選擇時(shí)容易混亂。同時(shí)測試材料取樣條件會(huì)受環(huán)境、植株自身狀態(tài)的影響。這些間接辦法過程復(fù)雜，耗時(shí)長，準(zhǔn)確性低。目前隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，流式細(xì)胞儀的使用越來越普及，采用流式細(xì)胞儀有效克服上述缺點(diǎn)，能快速、簡單、準(zhǔn)確的測定甜菜種質(zhì)的倍性，尤其是在早期快速高效地鑒定、篩選出目標(biāo)倍性水平植株材料已用于相關(guān)育種應(yīng)用[13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前國內(nèi)尚無關(guān)于利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定甜菜染色體倍性和DNAC-值的檢測方法的研究報(bào)道。研究利用流式細(xì)胞儀測定分析不同倍性甜菜的染色體?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以二倍體M39-8-4嫩葉為材料，以已知基因組的新疆野杏洛浦洪待克為外標(biāo)，建立適合于甜菜染色體倍性和基因組的流式細(xì)胞術(shù)測定方法，為甜菜的基因組學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和種質(zhì)資源研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

甜菜品種： M39-8-4超原 (二倍體)，02343劉福齊(二倍體)，7208 伊抗褐(四倍體)，需鑒定材料LSR88-5-1(二倍體或四倍體)均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所甜菜育種研究室提供。

1.2 方 法

1.2.1 解離液及 DNA 熒光染料的配制

配制細(xì)胞核解離液，所有解離液均需用真空泵抽濾(0.22 μm 濾膜)，去除大的顆粒、細(xì)菌等。預(yù)先配好的解離液均于4℃保存。核酸熒光染料是能插入雙鏈的碘化丙啶(propidium iodide, PI)，用于裝備488 nm激光 。在解離液中PI染液的終濃度50 μg/mL。并在PI 染液中加入適量 RNA 酶，排除RNA 的干擾。PI染液配制方法參照田新民[14]。表1

表1 常用細(xì)胞核解離液配方[5，7]

1.2.2 細(xì)胞核懸浮液的制備

避開主葉脈的選取葉片1.5～2 cm2，用蒸餾水沖洗2～3遍，再用去離子水沖洗2～3遍，濾紙吸干后放在清洗好的預(yù)冷培養(yǎng)皿中，加入解離液1.5 mL。將培養(yǎng)皿放在平整的冰袋上用刀片垂直、快速切碎后用200目濾膜過濾到1.5 mL離心管中， 4℃下孵育5～10 min，4℃1 000 r/min離心5 min，吸取上清棄之，在管中保留100 μL，再加入100 μL預(yù)冷的解離液。加入150 μL預(yù)冷的PI染料，輕輕混勻，在4℃下孵育10 min，上機(jī)待測。每個(gè)樣本獲得約250 μL細(xì)胞懸浮液。

1.2.3 上機(jī)檢測

流式細(xì)胞儀型號(hào)為 AccuriC6 (BD, 美國), 藍(lán)色激光488 nm激發(fā)，接受通道為波長范圍在585/40 nm的FL2的熒光。每個(gè)樣本做3次平行試驗(yàn)，每次至少收集1×104個(gè)顆粒。變異系數(shù)控制在5%以內(nèi)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

FCM通過記錄樣品的 G1/G0 和G2/M 期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，反應(yīng)基于對(duì)照和樣品的G1/G0峰的熒光強(qiáng)度值來計(jì)算 2C DNA 含量。所有植物的單倍體 DNA含量，也以質(zhì)量值pg和Mb (1 pg=978 Mb)計(jì)算。未知樣品的倍性水平和 DNA 含量計(jì)算如下：待測樣本DNA含量(pg/Mb)=對(duì)照樣本 DNA 含量×(待測樣品 G0/G1 峰熒光均值)/(對(duì)照樣品G0/G1峰熒光均值)[7]。使用Cytometer software workspace 軟件直接讀取變異系數(shù)的、進(jìn)行DNA 含量和倍性數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)分析。用Excel 2016 對(duì)數(shù)據(jù)做相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞核解離液的篩選

研究表明，用WPB解離液所制備的懸浮液上樣后不能形成峰值 ，其無法將甜菜嫩葉中細(xì)胞核完整釋放出來，收集細(xì)胞數(shù)少。Galbraith's、GP、LB01 、HEPES、MgSO4解離液有完整的峰，但峰幅較寬，在峰左右兩側(cè)出現(xiàn)背景碎片，有干擾峰出現(xiàn)。Marie's解離液制備甜菜嫩葉的細(xì)胞核解離液上樣后能形成左右對(duì)稱主峰，峰幅窄，CV值都在5%以下，上樣速率超過 200 events/μL，可重復(fù)性好，結(jié)果清晰、可靠。圖1

圖1 檢測甜菜倍性及 DNA 含量

2.2 檢測甜菜倍性

A、B分別是已確定倍性的M39-8-4超原(二倍體)和7208伊抗褐(四倍體)2份材料。二倍體材料M39-8-4超原，CV值為1.94%小于5% ，G0/G1峰值的均值為295 175.98，數(shù)據(jù)可靠；已知四倍體7208伊抗褐，CV值為 1.69%，G0/G1 峰值的均值為631 946.40，數(shù)據(jù)可靠。7208伊抗褐的熒光通導(dǎo)值約為M39-8-4超原的2倍，且CV值均小于5%，可以認(rèn)為用Marie's作為流式細(xì)胞術(shù)的解離液檢測甜菜樣本倍體是可行的。待測材料 LSR88-5-1的G0/G1 峰值的均值為295 390.29，CV值為 1.52%，與二倍體材料M39-8-4超原的值很接近，熒光通導(dǎo)值約為四倍體7208伊抗褐的一半，LSR88-5-1材料為二倍體材料。表2，圖2

注：A:M39-8-4超原; B:7208 伊抗褐; C:LSR88-5-1；D：洛浦洪待克

2.3 檢測甜菜DNA值

以新疆野杏洛浦洪待克為外標(biāo)，分別測定二倍體甜菜懸浮液和新疆野杏洛浦洪待克懸浮液的熒光強(qiáng)度為300 000左右，新疆野杏洛浦洪待克熒光強(qiáng)度為110 000。研究表明，二倍體M39-8-4超原、02343劉福齊和LSR88-5-1的均值分別是295 175、320 335和295 390，DNA含量分別是821.88 Mb、 891.94 Mb和822.48 Mb。四倍體7208伊抗褐均值631 946， DNA含量1 759.59 Mb，是二倍體材料的約2倍。表2

表2 利用流式細(xì)胞儀檢測甜菜倍性及DNA含量

3 討 論

FCM是通過流式細(xì)胞分析儀對(duì)大量處于分裂間期的細(xì)胞核內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測，經(jīng)儀器附設(shè)的計(jì)算機(jī)軟件統(tǒng)計(jì)分析，最后繪制出含量倍性的分布曲線圖，進(jìn)而推斷細(xì)胞的倍性[4-6]。具體是用G1期的DNA含量間接反映染色體倍性水平。用FCM一般可同時(shí)獲得植物細(xì)胞核DNA含量和倍性的數(shù)據(jù)。自1983年Galbraith運(yùn)用FCM測定了17種植物的細(xì)胞核DNA含量，流式細(xì)胞術(shù)越來越多利用在測定植物DNA含量和倍性上，如新疆野杏[7]、苜蓿[8]、梨樹[15]、棗和酸棗[16、17]、櫻屬[18]、鼠尾草[19]、草莓[20]等多種作物上開展。

流失細(xì)胞術(shù)測定的細(xì)胞必須處于單細(xì)胞懸浮液狀態(tài)，該技術(shù)關(guān)鍵在制備細(xì)胞核懸浮液和核酸熒光染色。如果細(xì)胞懸浮液制作不成功，會(huì)與未染色的陰性對(duì)照沒有顯著差別。不同植物的組織結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分存在較大差異，不同細(xì)胞核提取緩沖液及酶解液對(duì)植物的提取效果也不相同，大量研究報(bào)道表明，目前還沒有一種通用的植物細(xì)胞核解離液[5]。如報(bào)道中WPB解離液更多用在木本植物上，但新疆野杏并不適用[7]。在不同物種應(yīng)用FCM時(shí)，需要適當(dāng)改變緩沖液成分，從而獲得較高分辨率、提高結(jié)果的可靠性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性。如果想要FCM檢測甜菜倍性和DNA含量，篩選適合甜菜幼嫩葉片的細(xì)胞核解離液十分必要。常用于木本植物解離液WPB完全不適合，沒有峰形成。使用 Galbraith's、GP、LB01 、HEPES、MgSO4核解離液時(shí)，可以形成峰，但峰幅較寬，碎片較多，會(huì)形成干擾；Marie's細(xì)胞核解離液相對(duì)效果最好。與已發(fā)表其他植物相比，甜菜幼嫩葉片為材料時(shí)會(huì)多出一個(gè)較明顯的峰，其原因還需進(jìn)一步探討。試驗(yàn)中PI是一種目前相關(guān)DNA流式細(xì)胞術(shù)中普遍的熒光染料，用于裝備488 nm激光，能插入雙鏈DNA中。PI具有較高的分辨率及較低的毒性。這類染料除了能與雙鏈DNA結(jié)合，同樣也能與雙鏈RNA結(jié)合，在使用時(shí)同時(shí)加入了適量的RNAase。試驗(yàn)結(jié)果表明，加適量RNAase的50 μg/mL PI能作為探針。

在利用FCM時(shí)，一般要選著一個(gè)已知倍性或DNA-C值得作為參考，確定待測植物的倍性[21、22]。試驗(yàn)用FCM來檢測甜菜倍性和DNA含量。通過試驗(yàn)確定了FCM的適用性及其具體操作步驟、細(xì)胞核解離液及注意事項(xiàng)方法。因此，在試驗(yàn)時(shí)選擇了已明確倍性的、純度高的甜菜品系材料二倍體M39-8-4超原、02343劉福齊和四倍體7208伊抗褐和未知倍性LSR88-5-1的待測材料，同時(shí)選擇選取二倍體新疆野杏'洛浦洪待克'幼葉為外標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果能很好的區(qū)分甜菜二倍體和四倍體材料，數(shù)據(jù)重復(fù)性好、可靠。因試驗(yàn)材料的限制，沒對(duì)甜菜單倍體、三倍體進(jìn)行檢測。據(jù)耿小麗等[6]報(bào)道，利用FCM鑒定紫花苜?；ㄋ幱鷤M織的變異時(shí)，能清晰的檢測出二倍體、三倍體、四倍體以及二倍體加四倍體的嵌合體。利用FCM檢測甜菜倍性對(duì)今后甜菜育種和遺傳學(xué)研究應(yīng)用很有意義。

4 結(jié) 論

Marie's是最佳的解離液，測定值變異系數(shù)均小于5.0%。甜菜幼嫩葉片可作為進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測的理想材料，通過FCM檢測供試樣本可區(qū)分甜菜二倍體和四倍體，所測的二倍體DNA含量范圍為821～891 Mb/C，四倍體DNA 含量1 759 Mb/C。