郭錦晨，王 莖，孫宇潔，馮 燁

1安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，合肥 230012；2安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230038

高血壓是一個(gè)由環(huán)境因素和遺傳因素共同導(dǎo)致的多基因遺傳性疾病，以體循環(huán)動(dòng)脈血壓升高為主要特征，可伴有心、腦、腎等器官的功能或器質(zhì)性損害，是我國(guó)常見的心腦血管疾病之一，也是導(dǎo)致腦卒中、冠心病、心力衰竭的主要危險(xiǎn)因素[1]。隨著我國(guó)居民生活水平的日益提高，高血壓呈不斷增高趨勢(shì)，如治療不及時(shí)，嚴(yán)重影響人類健康與生命。中醫(yī)學(xué)將高血壓病歸屬于“頭痛”“眩暈”“風(fēng)?！钡确懂牐∫虿C(jī)多因臟腑氣血陰陽(yáng)失調(diào)，風(fēng)、火、痰、瘀、虛相兼為患，正虛為本，邪實(shí)為標(biāo)，臨床上多呈虛實(shí)夾雜的致病特點(diǎn)。治療上中藥具有多效性、增效減副性、多靶點(diǎn)性、前瞻性等特點(diǎn)，能夠保護(hù)高血壓患者靶器官、減輕毒副作用、提高生活質(zhì)量[2]，發(fā)揮著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)作用。

桑葉(Folium Mori，F(xiàn)M)是?？浦参锷orusalbaL.的干燥葉，菊花(Flos Chrysanthemi，F(xiàn)C)為菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序。兩者甘寒體輕，均入肺、肝二經(jīng)，臨床常協(xié)同為用，并走上焦疏風(fēng)清熱，同入下焦清熱平肝、益陰明目，在《通俗傷寒論》羚角鉤藤湯中二藥為臣，平肝潛陽(yáng)，清熱息風(fēng)，以助君藥清熱平肝之力。臨床兩者配伍?？捎糜谥委燂L(fēng)熱感冒、肺熱咳嗽、溫病初起、肝陽(yáng)上亢頭痛眩暈、目赤腫痛、目暗昏花、瘡癰腫毒等，現(xiàn)代醫(yī)家常取桑葉-菊花藥對(duì)平肝清肝之功用于高血壓的治療，能夠較好緩解高血壓所引起的頭痛、眩暈、目赤腫痛等癥狀[3]，但桑葉-菊花降壓的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不明確，研究報(bào)道亦較少。為此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接方法，分析桑葉-菊花治療高血壓的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，探究其降壓的潛在分子作用機(jī)制，以期為相關(guān)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 GEO芯片數(shù)據(jù)的獲取與處理

GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus，https://www.Ncbi.Nlm.nih.gov/geo/)是美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的基因表達(dá)綜合庫(kù)，以“hypertension/normal”為關(guān)鍵詞，來源為“Homo sapiens”，從該數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE75940基因表達(dá)譜的原始數(shù)據(jù)，所選取芯片利用R語(yǔ)言3.6.3進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。從中篩選高血壓樣本4例，正常樣本4例。所有樣本均采用GPL13497[Agilent-026652 Whole Human Genome Microarray 4x44K v2(Probe Name version)]平臺(tái)檢測(cè)，根據(jù)平臺(tái)注釋信息將探針轉(zhuǎn)化為基因名。

1.2 差異基因的篩選

芯片進(jìn)行處理和轉(zhuǎn)化后，利用R語(yǔ)言3.6.3(https://www.r-project.org/)中的limma包按照P-value<0.05，|log2FC|>0.5(FC表示差異表達(dá)基因上調(diào)或下調(diào)倍數(shù))的篩選條件篩選高血壓和正常動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的差異表達(dá)基因，負(fù)數(shù)代表下調(diào)、正數(shù)代表上調(diào)，對(duì)差異基因進(jìn)行聚類分析，利用R語(yǔ)言3.6.3中的pheatmap包繪制火山圖。

1.3 桑葉-菊花藥物活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選

通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/ tcmsp.php)檢索桑葉、菊花的化學(xué)成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和藥物相似性(drug-like，DL)≥0.18作為篩選條件，時(shí)間截止至2020年4月7日，篩選出活性成分較高的化合物。

1.4 “化合物-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

從DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)整合得到藥物活性成分靶點(diǎn)，利用Venn在線軟件(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將藥物與高血壓差異表達(dá)基因相關(guān)靶點(diǎn)取交集，運(yùn)用Cytoscape3.7.2(http:/ /www．cytoscape．org/)軟件構(gòu)建桑葉-菊花與高血壓“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行可視化分析。

1.5 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

利用Cytoscape 3.7.2軟件中Bisogenet插件對(duì)桑葉-菊花與高血壓關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析(protein-protein interaction，PPI)，再用CytoNCA插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)中所有點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)度中心性(degree centrality，DC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和介度中心性(betweenness centrality，BC)進(jìn)行分析，借助網(wǎng)絡(luò)拓?fù)淅砟詈Y選網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，篩選標(biāo)準(zhǔn)為DC大于所有節(jié)點(diǎn)2倍DC中位數(shù)，CC、BC大于所有節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)值的中位數(shù)。

1.6 GO功能富集和KEGG通路分析

將關(guān)鍵靶點(diǎn)上傳至David 6.8(Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/，Version 6.8)，以人類為研究對(duì)象，進(jìn)行基因功能(GO，gene ontology)分析以了解靶點(diǎn)主要的作用過程，主要包括生物過程(biological process，BP)，細(xì)胞組成(cellular component，CC)，分子功能(molecular function，MF)三方面。利用R語(yǔ)言3.6.3中的“clusterProfiler”包對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https://www.kegg.jp/)富集分析，并使用“ggplot2”包繪制氣泡圖，clusterProfiler優(yōu)勢(shì)在于可以實(shí)時(shí)抓取KEGG最新版本注釋得到更具時(shí)效性的富集注釋結(jié)果。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

檢索RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do)并下載高血壓靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)，檢索并下載TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)桑葉-菊花活性成分的2D結(jié)構(gòu)，利用Chem3D進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。利用PyMOL 2.4.0軟件對(duì)高血壓靶蛋白進(jìn)行除水、分離原配體等預(yù)處理。利用AutoDock的可視化軟件AutoDock Tools 1.5.6軟件設(shè)置GridBox各項(xiàng)參數(shù)，應(yīng)用AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，最后運(yùn)用PyMOL、LigPlot+軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行三維和二維可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 高血壓差異基因的篩選

基于GEO基因數(shù)據(jù)庫(kù)GSE75940的基因片段原始數(shù)據(jù)，設(shè)置log2(fold change)的絕對(duì)值>0.5和P-value<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，總共得出5 989個(gè)高血壓差異表達(dá)基因，其中包括2 864個(gè)下調(diào)基因和3 125個(gè)上調(diào)基因(見圖1)；下調(diào)和上調(diào)最顯著的40個(gè)基因見表1。

圖1 高血壓差異表達(dá)基因的火山圖Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes in hypertension

表1 高血壓差異表達(dá)的上調(diào)下調(diào)基因Table 1 Up-regulated and down-regulated genes differentially expressed in hypertension

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2.2 桑葉-菊花活性成分的篩選

在TCMSP中檢索桑葉-菊花所有成分?jǐn)?shù)據(jù)，根據(jù)口服生物利用度OB和藥物相似性DL，同時(shí)篩去無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的成分，最終篩選出桑葉25個(gè)主要活性成分，菊花17個(gè)主要活性成分(見表2)。

表2 桑葉-菊花的有效活性成分Table 2 Active components of FM-FC

續(xù)表2(Continued Tab.2)

2.3 “化合物-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

將DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)得到的所有靶點(diǎn)，刪除重復(fù)并去除假陽(yáng)性，整合得到桑葉、菊花活性成分作用靶點(diǎn)241個(gè)，與高血壓差異表達(dá)基因相關(guān)靶點(diǎn)取交集得到基因靶點(diǎn)41個(gè)，涉及桑葉-菊花活性成分29個(gè)，通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建桑葉-菊花與高血壓“化合物-靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)，主要活性成分有槲皮素、山奈酚、β-胡蘿卜素、花生四烯酸、金合歡素、木犀草素等，關(guān)鍵基因有JUN、MMP9、PTGS2、EGFR、CCND1、MMP1、SPP1等。

圖2 桑葉-菊花與高血壓“化合物-靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Visualized network diagram of "compound-target" between FM-FC and hypertension注：藍(lán)色三角形節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn)，橢圓形節(jié)點(diǎn)代表有效成分化合物(綠色為桑葉；黃色為菊花；紅色為桑葉-菊花)。Note:The blue triangle node represents the action target,and the oval node represents the active ingredient compound (green is FM;yellow is FC;red is FM-FC).

2.4 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

利用Cytoscape 3.7.2軟件中Bisogenet插件對(duì)41個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析，得到由2 303個(gè)節(jié)點(diǎn)和45 586個(gè)邊組成的網(wǎng)絡(luò)，與高血壓上調(diào)下調(diào)最顯著的差異表達(dá)基因交集的有IGFBP5、KIF5C、SH2D2A、MEP1B、F2、PZP。再用CytoNCA插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)中所有點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)(DC、CC和BC)進(jìn)行分析，選擇靶點(diǎn)DC值大于中位數(shù)2倍作為篩選核心靶點(diǎn)的條件，初步得到619個(gè)節(jié)點(diǎn)和20 405個(gè)邊組成的網(wǎng)絡(luò)，二次篩選以CC值>0.518得到310個(gè)節(jié)點(diǎn)和9 983個(gè)邊組成的網(wǎng)絡(luò)，最后BC值>147進(jìn)一步篩選，構(gòu)建了1個(gè)具有156個(gè)節(jié)點(diǎn)和3 808條邊的桑葉-菊花與高血壓的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(見圖3)。拓?fù)浞治龀?56個(gè)核心靶點(diǎn)信息，根據(jù)DC>185列舉出前50個(gè)見表3。

圖3 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作構(gòu)建及拓?fù)浞治鯢ig.3 Interaction construction and topological analysis of protein networks

表3 拓?fù)浞治?56個(gè)核心靶點(diǎn)信息(DC>185)Table 3 Topological analysis of 156 core target information (DC>185)

續(xù)表3(Continued Tab.3)

2.5 GO功能富集分析

利用DAVID平臺(tái)進(jìn)行GO功能富集分析，包括生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)和分子功能(MF)3個(gè)分支，設(shè)定閾值P<0.05，對(duì)篩選得到的41個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分析(見圖4)，這些靶點(diǎn)主要涉及對(duì)脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of smooth muscle cell proliferation)、缺氧反應(yīng)(response to hypoxia)等52條生物過程。CC分析可以看出靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞外空間(extracellular space)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(endoplasmic reticulum membrane)、細(xì)胞膜筏(membrane raft)等15條細(xì)胞組分。MF分析中可以看出，靶點(diǎn)主要涉及酶結(jié)合(enzyme binding)、絲氨酸內(nèi)肽酶活性(serine-type endopeptidase activity)、蛋白質(zhì)均聚活性(protein homodimerization activity)等13條分子功能。

圖4 桑葉-菊花活性成分治療高血壓靶點(diǎn)的GO富集分析Fig.4 GO Enrichment analysis of active components from FM-FC in treating hypertension

2.6 KEGG通路富集分析

使用clusterprofiler R包對(duì)41個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行KEGG通路分析，設(shè)定閾值為P<0.05，得到的39條KEGG通路富集，并繪制氣泡圖和通路-關(guān)鍵基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合表4和圖5、圖6，可知基因主要集中在IL-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路(Fluid shear stress and atherosclerosis)、催產(chǎn)素信號(hào)通路(Oxytocin signaling pathway)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)等通路上，主要基因有JUN、PTGS2、MMP9、PRKCA、CCND1、EGFR、CASP8、ELK1等。

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖(前20條)Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis (top 20)

圖6 KEGG通路-關(guān)鍵基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)Fig.6 KEGG pathway-key gene relationship network

表4 KEGG通路富集分析(前20條)Table 4 Enrichment analysis of KEGG pathway (top 20)

2.7 分子對(duì)接分析

將槲皮素、山奈酚、β-胡蘿卜素、花生四烯酸、金合歡素、木犀草素等桑葉-菊花的主要活性成分與JUN、PTGS2、MMP9、MMP1、CCND1等高血壓核心靶點(diǎn)進(jìn)行逐一對(duì)接，結(jié)合能小于0提示配體與受體可自發(fā)結(jié)合，且結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，所需結(jié)合能越低，≤-4.25 kcal/mol說明有一定結(jié)合活性，≤-5.0 kcal/mol說明有較好結(jié)合活性，≤-7.0 kcal/mol說明有強(qiáng)的結(jié)合活性(見圖7)。本研究選取結(jié)合能<-9.0 kcal/mol作為篩選條件(見表5)，同時(shí)運(yùn)用PyMOL和LigPlot+軟件將結(jié)合能前5位的對(duì)接結(jié)果制作2D和3D對(duì)接示意圖。綜合分析，槲皮素、木犀草素可能是桑葉-菊花降壓的關(guān)鍵活性成分。

表5 桑葉-菊花活性成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能Table 5 Binding energy of active components of FM-FC to targets

圖7 桑葉-菊花活性成分與靶蛋白對(duì)接二維及三維圖(結(jié)合能≤9.8 kcal/mol)Fig.7 Two-dimensional and three-dimensional maps of docking between active components of FM-FC and target protein (binding energy ≤9.8 kcal/mol)注：A～E分別為氧化血根堿與PTGS2、木犀草素與MMP9、桑辛素D與PTGS2、桑辛素H與PTGS2、β-胡蘿卜素與PTGS2的分子對(duì)接圖。Note:A-E are molecular docking diagrams of sanguinarine oxide and PTGS2,luteolin and MMP9,moracin D and PTGS2,moracin H and PTGS2,and β-carotene and PTGS2,respectively.

3 討論

高血壓是腦卒中及冠心病發(fā)病的首要危險(xiǎn)因素，是全球?qū)е滤劳龅淖钪匾蛩刂?，中醫(yī)病因病機(jī)復(fù)雜，病機(jī)多見陰虛陽(yáng)亢動(dòng)風(fēng)、痰濕瘀血阻滯等，病位多責(zé)之于肝、腎、脾，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其發(fā)病受多個(gè)環(huán)節(jié)、多種機(jī)制(RAAS、氧化應(yīng)激、炎癥、神經(jīng)-免疫因素、非編碼RNA)和多種因素相互影響[4]。桑葉“乃箕星之精，箕好風(fēng)，故善搜風(fēng)”(《成方便讀》)，菊花 “得金水之精英尤多，能益金水二臟也。補(bǔ)水所以制火，益金所以平木”(《本草綱目》)，桑葉、菊花是臨床常用的經(jīng)典藥對(duì)，雖為輕平之品，但可益肺平肝，使腎水充足，涵養(yǎng)肝性，清泄肝熱，常用治療高血壓引起的眩暈、頭疼、急躁易怒、面紅目赤等癥，但具體藥學(xué)物質(zhì)和作用機(jī)制仍不清楚。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究模式，篩選出桑葉-菊花與高血壓41個(gè)共同作用蛋白，涉及活性成分29個(gè)，拓?fù)浞治龀?56個(gè)核心靶點(diǎn)信息，39條通路與高血壓有關(guān)，體現(xiàn)了桑葉-菊花“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”之間共同作用治療高血壓的機(jī)制。

根據(jù)表2、圖2可知，治療高血壓的主要活性成分可能有槲皮素、山奈酚、β-胡蘿卜素、花生四烯酸、金合歡素、木犀草素等，其中槲皮素、山奈酚為桑葉-菊花共有，槲皮素可減少氧化應(yīng)激、干擾腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)和以內(nèi)皮依賴性和改善血管內(nèi)皮-1(ET-1)和NO平衡，從而改善血管內(nèi)皮功能，降低血壓[5]。山奈酚可內(nèi)皮依賴性舒張血管，抑制血管緊張素Ⅱ?qū)е碌难苤貥?gòu)，還可通過抑制IKK/NF-κB炎癥損傷IRS-1改善II型糖尿病大鼠的胰島素抵抗，并對(duì)其具有調(diào)血脂作用[6]。β-胡蘿卜素能降低低密度脂蛋白(LDL)氧化，消除自由基，預(yù)防血管損傷[7]?；ㄉ南┧崾巧Ｈ~所含脂類，有防治動(dòng)脈粥樣硬化和抗血栓的作用[8]。金合歡素、木犀草素是菊花中含有的黃酮類化合物，菊花總黃酮可調(diào)節(jié)NO介導(dǎo)途徑控制鈣、鉀離子通道，具有保護(hù)血管舒張反應(yīng)性、擴(kuò)張血管等作用[9]，木犀草素還具有清除自由基和保護(hù)細(xì)胞能力，且在體內(nèi)與其他抗氧化劑協(xié)同顯著增加抗氧化作用。此外，收集到主要活性成分治療高血壓靶點(diǎn)41個(gè)，涉及多個(gè)炎癥、抗氧化、血管生成、血管重構(gòu)等因子，表明了桑葉-菊花可通過多成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮協(xié)同降壓作用。

網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鍪菑牡鞍紫嗷プ饔镁W(wǎng)絡(luò)體系中多層次、多角度地挖掘相關(guān)信息，并從中篩選出具有特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)的多靶點(diǎn)藥物分子，為預(yù)測(cè)藥物與疾病之間的相互關(guān)系提供參考[10]。本研究對(duì)41個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作及拓?fù)鋮?shù)分析，得到1個(gè)以EGFR、JUN、PRKCA為核心靶點(diǎn)的具有156個(gè)節(jié)點(diǎn)和3 808條邊的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，一方面進(jìn)一步篩選了關(guān)鍵靶點(diǎn)，一方面擴(kuò)大了相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)，為GO功能富集、KEGG通路分析和分子對(duì)接驗(yàn)證提供了佐證。根據(jù)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果表3、圖3，結(jié)合表1和圖2、6可知，其中關(guān)鍵作用靶點(diǎn)有JUN、MMP9、PTGS2、EGFR、CCND1、MMP1、SPP1、PRKCA、ELK1、IGFBP5、KIF5C、SH2D2A、MEP1B、F2、PZP等。研究表明，高血壓發(fā)病機(jī)制主要與RAAS激活、交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)、胰島素抵抗、水鈉潴留、膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)異常及血管內(nèi)皮功能紊亂等有關(guān)[11]，導(dǎo)致血管收縮、損傷、重構(gòu)，血壓升高。其中，Jun激酶(JUN)通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控調(diào)節(jié)VSMCs增殖、遷移、ROS產(chǎn)生和胞外基質(zhì)降解的細(xì)胞過程的多種基因[12]。基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)參與正常生理過程中細(xì)胞外基質(zhì)的分解，可通過釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)以參與血管生成，而基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)活性增高，高血壓相關(guān)的微血管功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)亦增高[13]。前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2(PTGS2)是一種誘導(dǎo)性即刻反應(yīng)基因，受到細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、缺氧等刺激可迅速上調(diào)，主要產(chǎn)物前列腺素具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管生成等生物學(xué)活性[14]。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)廣泛分布于哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等有重要作用，功能缺失或其相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵因子活性異常，均會(huì)引起心血管疾病及免疫缺陷等發(fā)生[15]。周期蛋白D1基因(CCND1)具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分化的作用，在細(xì)胞受到損傷時(shí)啟動(dòng)子上游的LncRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可與TNA結(jié)合蛋白TLS結(jié)合[16]。蛋白激酶C-α(PRKCA)基因是絲氨酸-蘇氨酸特異性蛋白激酶C家族的成員，涉及血管平滑肌收縮和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子通路，參與鈣離子調(diào)控和血管平滑肌收縮[17]。分子對(duì)接進(jìn)一步證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的成分篩選結(jié)果，結(jié)果表明潛在靶點(diǎn)PTGS2、MMP9、MMP1與槲皮素、木犀草素，PTGS2與山奈酚、β-胡蘿卜素、金合歡素等具有較好的結(jié)合活性，而且結(jié)合體構(gòu)象穩(wěn)定，表明這些可能為桑葉-菊花治療高血壓的關(guān)鍵成分和靶點(diǎn)。

對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，進(jìn)一步探究桑葉-菊花治療高血壓的作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桑葉-菊花可能通過參與脂多糖的反應(yīng)、對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)、缺氧反應(yīng)、氧化還原過程、蛋白質(zhì)分解代謝過程的調(diào)控等生物學(xué)過程，在細(xì)胞外空間、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、細(xì)胞膜筏等部位，發(fā)生酶結(jié)合、絲氨酸內(nèi)肽酶活性、蛋白質(zhì)均聚活性、血紅素結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等分子反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控IL-17信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、癌癥中的微小核糖核酸信號(hào)通路等發(fā)揮降壓作用。TNF、IL-17信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)有關(guān)[18]，TNF信號(hào)通路異常調(diào)節(jié)會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，平滑肌細(xì)胞增生，血管外周阻力增加而引起高血壓，IL-17信號(hào)通路可誘導(dǎo)多種組織和細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子、趨化因子和金屬蛋白酶的表達(dá)[19]。流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路主要與血液流變學(xué)有關(guān)，較低的血流剪切力易導(dǎo)致動(dòng)脈硬化形成或斑塊破裂、內(nèi)皮損傷，MMP-9、CRP水平升高，較高的血流剪切力有利于維持血管內(nèi)皮的正常功能，保護(hù)血管內(nèi)膜，防止高血壓的發(fā)生[20]。microRNAs(miRNAs)是內(nèi)源性非編碼RNA小分子，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，可以通過調(diào)控AT1R基因、鹽皮質(zhì)激素受體基因的表達(dá)，抑制RAAS的功能，減少水鈉潴留，還可調(diào)控SRF、IRF、GAX等基因的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，參與高血壓的發(fā)生發(fā)展[21]。同時(shí)，PTGS2、JUN、MMP1、MMP9、CXCL2等關(guān)鍵靶點(diǎn)也顯著富集在這些通路上，充分證明了桑葉-菊花具有多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同增效的降壓作用。

綜上，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法系統(tǒng)地分析了桑葉-菊花治療高血壓的分子作用機(jī)制，揭示了桑葉-菊花可能通過槲皮素、山奈酚、β-胡蘿卜素、花生四烯酸、金合歡素、木犀草素等潛在藥效成分，作用于JUN、MMP9、PTGS2、EGFR、CCND1、MMP1、PRKCA等多個(gè)靶點(diǎn)，通過IL-17信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路和癌癥中的微小核糖核酸信號(hào)通路等，參與血管舒縮、鈣鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)、血管內(nèi)皮功能、炎癥反應(yīng)、糖脂代謝和氧化應(yīng)激等發(fā)揮降壓的作用，證明了桑葉-菊花治療高血壓具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn),為進(jìn)一步探討其發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究提供方向，其后續(xù)尚需體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)其功效網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)在關(guān)聯(lián)和作用靶點(diǎn)。