薛欣怡，張 翼，劉亞月

廣東海洋大學食品與科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，湛江市腦健康海洋藥物與營養(yǎng)品重點實驗室，廣東海洋大學海洋藥物研究所，湛江 524088

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)，是一種慢性神經退行性疾病，多發(fā)于65歲以上的老年人。臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認、視空間技能損害和執(zhí)行功能障礙等為特征[1]。目前AD已成為全球范圍內亟需解決的社會問題和醫(yī)學問題。據2020年世界阿爾茨海默病事實和數據報告[2]指出，當年全球該病患者超過5 200萬。平均每3秒就有1人罹患AD，預計到2050年該數據將會增長至1.52億。而在中國，超過1 450萬人正在遭受AD困擾，約占世界總病例數的四分之一，居世界首位。但是目前針對該疾病的藥物研發(fā)卻一直沒有很好的進展。1998～2017年期間，全球超過146個AD藥物在臨床階段宣布失敗，臨床失敗率高達97.3%[3]。2019年我國自主研發(fā)的藥物“GV-971”宣布上市，這將為患者提供新的用藥選擇。但該藥也只對AD輕、中度患者有效，只能在一定程度上改善患者的認知功能。因此，AD新藥研發(fā)的形勢依然嚴峻。

目前關于AD的特征性病理變化研究發(fā)現，患者大腦表面會出現β-淀粉樣蛋白(amyloid-protein，Aβ)的異常沉積，形成老年斑；以及患者腦內Tau蛋白過度磷酸化，在神經細胞內形成神經元纖維纏結，并伴有神經膠質細胞的增生[4]。目前關于AD的發(fā)病機制主要有“β-淀粉樣蛋白(Aβ)假說”、“Tau蛋白假說”、“氧化應激學說”，“金屬離子代謝紊亂學說”，“神經炎癥假說”“膽堿能損傷學說”等[5]。其中膽堿能損傷學說是最早提出的關于AD的發(fā)病機制學說，也是目前大部分AD藥物研發(fā)的理論基礎。該假說認為膽堿能活性喪失與AD患者的病癥嚴重程度有關。對AD患者進行尸檢發(fā)現，其基底前腦區(qū)域神經元丟失，乙酰膽堿酯酶和膽堿乙酰轉移酶活力下降，從而導致膽堿攝取合成能力降低，學習記憶功能的減退和認知功能障礙[6]。因此，研制出可以改善體內膽堿系統(tǒng)功能的藥物一直是治療AD疾病的重要方向之一。

乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)屬于絲氨酸水解酶類，主要存在于神經系統(tǒng)中，其活性中心主要由酶解部位、陰離子和與疏水性區(qū)域三部分組成[7]。AChE是生物神經傳導中的一種關鍵性酶，能夠催化膽堿能突觸間隙的神經遞質乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)水解成膽堿和乙酸，終止信號刺激，阻斷神經信號在體內的正常傳遞[8]。而現有研究表明ACh是參與學習和記憶的最重要的神經遞質，故提高腦內ACh水平可有效改善AD患者的認知和學習記憶能力[9]。乙酰膽堿酯酶抑制劑(acetylcholinesterase inhibitor，AChEI)是一種能對AChE進行可逆性抑制的物質，它可使ACh在突觸處積累，含量增加，保證神經信號在體內的正常傳遞，從而改善學習和記憶等功能，是目前臨床上最為廣泛使用的AD治療藥物[10]。

1 現有AChEIs藥物簡介

截至目前，FDA批準可用于治療AD的5種藥物中除了美金剛屬于NMDA受體拮抗藥外，其余4種[他克林(tacrine)、利斯的明(rivastigmine)、多奈哌齊(donepezil)和加蘭他敏(galanthamine)]均屬于AChEIs[11]。Tacrine是最早用于治療AD的藥物，可改善AD病人的認知和識別功能；但其毒副作用較大，尤其對肝臟毒性大，且會引起體內轉氨酶水平的升高。故目前該藥物已經很少被使用。Rivastigmine則是一種假性不可逆氨基甲酸AChEIs。它是人工合成的毒扁豆堿的氨基甲酸衍生物，結構中含有季胺基團，但不易通過血腦屏障，治療效果并不顯著[12]，且服用利斯的敏類藥物后常會產生泌尿系統(tǒng)與呼吸道系統(tǒng)感染，高血壓，心房顫動，神經錯亂等各種反應。Donepezil則是目前全世界應用最廣泛的AChEI，具有選擇性高、作用時間長，耐受性良好，無肝毒性等優(yōu)點；但大部分患者服用后會產生腹瀉、肌痛、嘔吐、疲勞、失眠、頭暈和肌痙攣等較為顯著的不良反應。Galanthamine是從雪花蓮和其它幾種石蒜科植物中提取出來的生物堿，該藥在AD治療初期，患者有腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐和厭食等不良反應[13]。綜上所述，目前臨床使用的AChEIs藥物都能在一定程度上對AChE進行可逆性抑制，從而改善AD患者的認知水平。但是其大多存在半衰期短或較嚴重的外周膽堿能系統(tǒng)副作用等缺點，不利于患者長期服用。因此，開發(fā)尋找具有適宜患者長期服用、選擇性高、毒副作用小、且作用面廣等優(yōu)點的AChEIs受到科研工作者的廣泛關注[14]。

2 來源于天然產物的AChEIs

天然產物一直是藥物發(fā)現的重要資源。目前已發(fā)現的AChEIs的來源多為植物和微生物，如現有藥物galanthamine和rivastigmine，還有石杉堿甲、毒扁豆堿、小檗堿等也是目前已研發(fā)證明具有高活性、選擇性強，來源于天然產物的AChEIs[15]。從Eadie等[16]報告中我們得知,早在1864年，Jobst等就從非洲西部毒扁豆PhysostigmavenenosumBalf的種子中分離得到一個四氫吡咯并吲哚環(huán)系的天然生物堿—毒扁豆堿，該化合物對AChE具有極強的抑制活性，這是已知最早的天然AChEI。而后國內外科學家從各類中藥、動植物、微生物等天然資源中發(fā)現了一批具有顯著活性的AChEIs。例如，Ramli等[17]從植物Stichoneuroncaudatum中分離得到四個新的生物堿，其中sessilistemonamines E對AChE具有顯著的抑制活性，IC50值為9.10 μM。Zhao等[18]從PhlegmariurushenryiChing中分離得到5個新骨架石松生物堿類化合物。藥理活性研究表明，化合物phleghenrines A和D具有顯著的AChE抑制活性(IC50值分別為4.91和4.32 μM)，同時化合物phleghenrine D對丁酰膽堿酯酶不顯示抑制活性，是一個極具潛力的治療AD的先導化合物。Zhan等[19]從植物Zephyranthescandida的提取物中分離得到了若干個對AChE具有極強抑制活性的新生物堿。Cui等[20]也從中藥加味補中益氣湯中發(fā)現了5個具有顯著抑制AChE的呋喃酮類化合物，其IC50均小于12 μM。隨著現代分析和物質結構鑒定技術的進步，越來越多的AChEIs被發(fā)現，但是這只涉及天然資源中的極小一小部分。自然界中大量的微生物和植物中的AChEIs的篩選工作尚少，具有巨大的開發(fā)潛力。但是天然產物成分往往比較復雜，因此選擇一種合適的活性模型來對自然界中潛在的AChEIs進行快速篩選，具有重要的意義[21]。

3 天然來源的AChEIs的篩選方法

目前，AChEIs的篩選方法主要有基于紫外分光光度計的Ellman’s比色法、TLC薄層生物自顯影法、熒光分析法、液相色譜與質譜聯(lián)用等方法[22]。

3.1 基于紫外分光光度計的Ellman’s比色法

基于紫外分光光度計的Ellman’s比色法是最早用于AChEIs篩選的方法，其篩選原理為：乙酰膽堿酯酶水解底物硫代乙酰膽堿為硫代膽堿；硫代膽堿再與顯色劑DTNB(5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸))反應生成在波長為405 nm處有特征吸收的化合物5-硫-2-硝基苯甲酸。AChEIs的加入可以顯著抑制AChE的活性，因此可以通過紫外分光光度計測定吸光度的增減量，進而間接測定待測樣品對AChE的抑制活性[23]。2020年Okello等[24]從綠茶中分離得到5種天然黃烷-3-醇化合物，采用Ellman’s比色法篩選其對AChE的抑制活性，發(fā)現EGCG對AChE有顯著抑制作用，其IC50值小于0.02 μmol/mL。Xiao等[25]從紅樹林中分離出兩個新骨化合物asperterpenol A和asperterpenol B，并采用改良的Ellman’s比色法測定了其對AChE和BuChE的抑制作用，結果發(fā)現兩種化合物都具有強烈的AChE抑制能力，其IC50值分別為2.3和3.0 μM，但均不能抑制BuChE，可作為一種天然有效的AChE抑制劑。Mahsa等[26]以白楊的甲醇餾分為原料，研究了其粗提物的抗氧化活性及AChE抑制作用，從中檢出了五個化合物，并利用Ellman’s比色法發(fā)現黃酮化合物quercetin具有較強的抗氧化作用，其IC50值為10.2 μg/mL。而Caffeic acid則表現較強的AChE抑制作用，其IC50值為12.1 μg/mL。綜上可知，Ellman’s比色法具有操作簡單、耗費低等優(yōu)點，從而得到了廣泛的使用[23-28]。但是由于該法利用的是物質的紫外吸收，而天然來源的化合物多為有顏色的一類物質，易干擾比色法的測定。因此該法不適合于篩選本身具有顏色的化合物，否則容易出現假陽性結果[29]。

3.2 TLC薄層生物自顯影法

TLC(thin-layer chromatography)薄層生物自顯影法是一種快速靶向追蹤分離、篩選活性成分的方法。其原理與基于紫外分光光度計的Ellman’s比色法一致，但此方法的操作過程更為簡便、成本更低，且能隨時對活性物質進行追蹤[30]。此方法通常先將樣品在薄層板上展開，然后噴上AChE和顯色劑，在恒溫恒濕的條件下培養(yǎng)20 min后再噴上適量底物。若樣品中成分有抑制AChE活性，則顯現白色斑點。Nokuthula等[31]研究了一種南非莧科植物抑制AChE的活性實驗，并進行活性化合物的分離與其結合酶分子對接能力的檢測。在利用TLC技術對41個代表樣品進行AChE抑制活性體外評價時發(fā)現，活性最強的品種為AmaryllisbelladonnaL、Nerinehuttoniae和Nerineundulata(L.)，其IC50值分別為14.3、45.3和52.8 μg/mL，并在甲醇提取物中追蹤到若干個具有顯著活性的化合物，為后續(xù)研究提供了較為可靠地實驗依據。Cai等[32]對從Piper等芳香植物中提取的23個香精油(EOS)進行化學成分分析發(fā)現其中富含倍半萜和苯丙烷類，采用TLC對組氨酸二聚體中活性最強的活性成分進行鑒別，最終確定其為細辛霉素，對AChE具有較好的抑制作用(IC50值為0.44 mg/mL)。Fabio等[33]對來自加勒比海的軟珊瑚(Eunicea和Plexaura)分離出的14種化合物進行AChE抑制活性評價，發(fā)現化合物asperdiol、asperdiol diacetate和8R-dihydroplexaurolone均顯示較強的活性斑點，并對化合物14-acetoxycrassine和asperdiol進行定量檢測，其IC50分別為1.40和0.36 μM。Zhang等[34]采用TLC薄層生物自顯影的方法對44株海洋來源真菌的AChE活性成分進行了篩選與追蹤，研究發(fā)現有32株真菌具有明顯的AChE抑制斑點，表明其中含有潛在的抑制AChE的活性成分，這為結構多樣化AD活性物質的研究提供了有益啟示。但此方法耗時較長，誤差大，易出現假陰性結果，一般只能用于定性測定，研究者經常將TLC薄層生物自顯影法與Ellman’s比色法聯(lián)用，以保證實驗結果更加真實可靠[35]。

3.3 熒光分析法

熒光分析法也是一種可用于天然AChEIs的篩選方法，具有高靈敏度、檢測下限低、簡單快速等優(yōu)點。其篩選原理主要是利用物質的熒光特性，當無熒光的物質在被AChE水解后會生成有熒光物質，可以通過監(jiān)測該物質的熒光變化情況間接測定AChE活性，常采用的是熒光探針和熒光猝滅效應等方法[36]。Cai等[37]以熒光銀納米簇DNA-AgNCs為載體，根據氯化硫代乙酰膽堿被AChE水解后生成的TCh會與DNA-AgNCs反應使DNA-AgNCs的熒光性增強的原理，檢測了tacrine在635 nm處的熒光變化情況，得出其IC50為4.7 nM。該結果比文獻報道值小，這說明此方法酶與底物的用量比其他方法少，更加經濟方便。Han等[38]利用硫代膽堿對方酸染料的熒光猝滅效應，根據氯化乙酰硫代膽堿和ACh能競爭性的與AChE結合的原理，來調控硫代膽堿的生成量，使體系的熒光信號發(fā)生改變。結果表明當待測體系中存在有機磷抑制劑時，AChE的催化活性受到有機磷的特異性抑制，酶對底物的水解作用減弱，硫代膽堿的生成量也會相應的減少，體系熒光信號發(fā)生改變，最終可實現對有機磷的檢測。Liu等[39]采用熒光分析法研究了香豆素類化合物與AChE相互作用，發(fā)現該類化合物對AChE的內源熒光具有較強的猝滅作用。但熒光分析法的缺點是穩(wěn)定性差，易受干擾，并且不是所有物質都具有熒光性，因此它的使用范圍受到較大限制。

3.4 液相色譜-質譜聯(lián)用法

高效液相色譜-質譜法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)是近代發(fā)展起來的以HPLC為分離手段，MS為鑒定工具的高效分析分離技術。其原理是底物乙酰膽堿在AChE的作用下生成膽堿，經過HPLC分離后，通過MS測定其底物的減少量來間接確定待測樣品的AChE抑制活性。該方法將HPLC對復雜樣品的高分離能力與MS的結構鑒定能力結合起來，具有分析速度快，靈敏度高等優(yōu)點[40]。尤其對于缺乏特征紫外吸收和不易分離的物質具有獨特優(yōu)勢。Gokhan等[41]利用HPLC-MS方法對Ferulahalophila的誘變/抗誘變活性進行評價，建立了該植物的化學成分譜。實驗發(fā)現在丙酮提取物中酚類和黃酮類的含量最高，氯仿提取物對AChE的抑制作用顯著，表明該植物可能是一種有希望的AChEI來源，具有較高的生物潛力與藥用價值。Placines等[42]采用HPLC-MS對可食用鹽生植物CakilemaritimaScop的主要代謝產物進行定量和AChE抑制試驗，發(fā)現其類黃酮提取物對AChE具有顯著的抑制活性。Zhao等[43]利用HPLC-DAD-ESI-Q-TOF/MS技術發(fā)現Coptischinensis植物根莖中的五種生物堿類化合物均具有較好的AChE抑制活性，其中化合物palmatine的活性最好，IC50值為36.6 μM。Kahraman等[44]也通過該技術比較了F.caspica和F.halophila根莖與地上部分的植物化學特性，實驗發(fā)現5-caffeoylquinic acid是F.caspica和F.halophila提取物中的主要成分，其甲醇提取物都有較高的AChE抑制活性與抗氧化能力，且F.caspica地上部分的甲醇提取物比F.halophila的AChE抑制活性高，其IC50值為0.044 33 μg/mL，這可能與它們提取物中總酚與類黃酮的含量有關，但F.caspica氯仿提取物的高總酚含量與其抗氧化活性和AChE抑制活性無關。

超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatograph，UPLC)是近年來發(fā)展起來的一種適用于微量或痕量物質快速檢測的技術。它是在傳統(tǒng)的HPLC方法上發(fā)展的，采用更小顆粒填料色譜柱、更快速的檢測手段及超高壓系統(tǒng)結合的新興液相色譜技術[45]。與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC具有高分離度、高速度、高靈敏度等優(yōu)點。在全面提升HPLC的速度、靈敏度和分離度諸品質的同時，保留其原有的實用性及原理[46]。其最顯著的優(yōu)勢是可以縮短分析時間，提高工作效率。如針對某有關物質進行分析，使用HPLC運行1針需要75 min，而UPLC只需要10 min就可以完成整個過程，分析效率提高將近7.5倍。當然，分析效率提高這么多，其配套設備要求也隨之增加。UPLC需要小顆粒雜化填料(1.7 μm)的色譜柱、更高耐壓(達15 000 Psi)、低系統(tǒng)體積的輸液單元[47]。由于此方法具有高分離度，高靈敏性，分析周期短等優(yōu)點，可為復雜、痕量物質體系的分離分析提供良好的平臺?，F已廣泛應用于農藥殘留物檢測，水質和環(huán)境監(jiān)測，化妝品質量控制，中藥復雜組分分析及代謝組學等領域。

Wang等[48]采用親和超濾超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質結果實驗發(fā)現這四種藥用植物都具有較強的抑制活性。其中鉤藤中的活性化合物可能為3-二氫異卡丹賓、鉤藤堿、柯諾辛等。Liu等[49]采用UPLC-Q-TOF-MS技術對D.auriculatum植物的化學成分進行調查，發(fā)現其中有五個生物堿化合物均表現較好的AChE抑制活性，其IC50值為0.24～6.37 μM。Farag等[50]基于UPLC-MS技術檢測Ocimum植物的AChE抑制活性，并對O.basilicum、O.africanum、O.americanum和O.minimum四種酚類物質的代謝差異進行評估，結果發(fā)現O.americanum、O.africanum、O.basilicum的IC50值為2.5～6.6 mg/mL，并且對從Ocimum提取物中獲得的化合物caftaric、chlorogenic和rosmarinic進行活性測試，得出其IC50值分別為24、0.5和7.9 mg/mL。采用UPLC方法進行分析可極大的提高其分析效率，但同時對樣品的前處理要求也更嚴格。如果樣品前處理不干凈就會有很多雜峰，基線也會很高；同時由于UPLC色譜柱的填料粒徑均很小，因此容易造成色譜柱堵塞。最后由于實驗過程中儀器內部壓力過大，也會產生相對應的問題。例如泵的使用壽命會相對降低，儀器的連接部位老化速度加快，包括單向閥等部位零件容易出現問題等[51]。

4 總結

天然產物由于其本身具有結構多樣化等優(yōu)勢，是目前最大、最好的藥物來源庫。隨著提取分離和結構鑒定技術的快速發(fā)展，從天然產物中開發(fā)藥物的速度和競爭力顯著提高[52]，這為尋找作用面廣，毒副作用小，適合長期服用的新型AChEIs提供了新思路。同時隨著針對AChEIs篩選的科學技術的不斷創(chuàng)新，科學儀器的不斷進步，并且對AD的確切病因研究逐漸深入，我們堅信會從天然產物中發(fā)現更多化學結構新穎，效果顯著的化合物，最終戰(zhàn)勝AD。