呂 樂，莫小葉，龐美霞，孫海燕*

1深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院博士后創(chuàng)新基地；2深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 深圳市發(fā)酵精制檢測系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳518055

肝臟是機(jī)體重要的解毒器官，參與調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)糖、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝，也是外源性物質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)化的主要場所[1,2]。因此，病毒性肝炎、酒精性脂肪肝、肝纖維化、肝硬化和肝癌等肝臟機(jī)能的損傷會對機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[3,4]。肝臟內(nèi)含有大量的Ⅰ相、Ⅱ相藥物代謝酶，及多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[5,6]。Ⅰ相藥物代謝酶主要為CYP450酶系，負(fù)責(zé)氧化、還原、水解過程，可催化多種藥物、毒物、前致癌物等外源性物質(zhì)的代謝。Ⅱ相代謝酶主要包括尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferase，UGT)、硫酸基轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferase，SULT)，催化Ⅰ相代謝酶產(chǎn)物與葡萄糖醛酸、硫酸、谷胱甘肽等共價(jià)結(jié)合，生成水溶性更好的產(chǎn)物，從而利于代謝產(chǎn)物的排除。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC)主要包括P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance related proteins，MRPs)，他們屬于同一家族，廣泛存在于多種正常的組織和器官，參與藥物、內(nèi)/外源物質(zhì)的吸收、分布、排泄，具有解毒和防御保護(hù)作用[7,8]。

茶葉制作過程大體包括殺青、發(fā)酵、捻揉和干燥4個(gè)步驟，根據(jù)其加工方法和發(fā)酵程度，分為白茶、黃茶、綠茶、黑茶、紅茶、青茶。茶葉具有很好的抗氧化作用，在體內(nèi)外都有抗自由基的活性[9]。茶葉中的生理活性物質(zhì)主要為茶多酚，包括兒茶素類、花色苷、黃酮類等，也是茶葉抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[10,11]。綠茶是指未經(jīng)發(fā)酵過的茶葉，龍井綠茶是我國四大名茶之首，素有“綠茶皇后”的美譽(yù)。有關(guān)綠茶有效成分生理功能的研究已經(jīng)成為近年來的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

本團(tuán)隊(duì)前期研究表明龍井茶多酚提取物對小鼠肝臟內(nèi)的CYP450有調(diào)節(jié)作用，但對Ⅱ相藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用尚不明確。因此，本文在前期研究基礎(chǔ)上，探討龍井茶多酚提取物對C57BL/6J小鼠肝臟Ⅱ相代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響，以及其對氧化應(yīng)激的抵抗作用、以期為龍井茶多酚提取物的深度開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶葉

西湖龍井綠茶茶葉購自于深圳一品軒茶莊，粉碎，常溫避光在干燥罐保存。

1.1.2 動(dòng)物

購自于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心6～8周齡的SPF級雄性C57BL/6J小鼠[許可證號SCXK(粵)2016-0041]，體重20±2 g。

1.1.3 試劑與儀器

SOD、CAT、GSH、GSH-Px測試試劑盒(南京建成生物工程研究所)；MRP2、CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4兔多克隆抗體、P-gp、UGT1A6、GAPDH兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體(Abcam公司，USA)；SULT1A1兔多克隆抗體(Bioss公司)；Wes(Protein Simple，San Jose，USA)；顯微鏡(NIKON Eclipse ci，Japan)；成像系統(tǒng)(NIKON digital sight DS-FI2，Japan)。

1.2 龍井茶多酚提取物制備及含量測定

1.2.1 龍井茶多酚提取物的提取方法

龍井茶多酚提取物的提取參照國家標(biāo)準(zhǔn)(GBT8313-2018)并根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件稍作調(diào)整：取20 g過篩的龍井茶粉末，按1∶25(W/V)的比例加入70 ℃預(yù)熱的70%甲醇，70 ℃水浴浸提30 min。浸提后，將體系冷卻至室溫，布氏漏斗抽濾，濾渣繼續(xù)同法重復(fù)浸提2次。合并3次提取濾液，濃縮至原體積的15%～20%，確保甲醇幾乎被除盡，濃縮液采用氯仿3∶1(V/V)萃取一次，分層后棄去氯仿層，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將水萃取層濃縮至原體積的5%，適量超純水復(fù)溶。10 000 rpm，4 ℃離心15 min，上清液冷凍干燥后，常溫避光干燥保存。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用Folin-Ciocalteu法測定龍井茶多酚提取物中總多酚的含量[12,13]。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及分組

40只C57BL/6J小鼠隨機(jī)均等分為4組：對照組(control)、龍井茶多酚提取物37.5、75、150 mg/kg實(shí)驗(yàn)組。龍井茶多酚提取物實(shí)驗(yàn)組給予相應(yīng)劑量的龍井茶多酚提取物，空白對照組給予生理鹽水，灌胃體積均為0.1 mL/10 g·BW。各組連續(xù)灌胃6次，末次灌胃后8 h，摘眼球取血，分離小鼠肝臟。

蘇佩斯的觀點(diǎn)引發(fā)了更多學(xué)者對科學(xué)理論問題的關(guān)注，薩普、范·弗拉森和史納德等人在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步對經(jīng)驗(yàn)科學(xué)的邏輯結(jié)構(gòu)和模型結(jié)構(gòu)加以探討，形成了一種新的“公認(rèn)觀點(diǎn)”，從而促使對科學(xué)理論的理解得到了進(jìn)一步的拓展。展開來說：

1.2.3 血清中ALT和AST含量測定

摘眼球取小鼠全血，4 ℃冰箱靜置過夜，之后2 500 rpm，4 ℃，離心15 min，上層黃色液體即為血清。按說明書操作測定ALT、AST含量。

1.2.4 肝臟中GSH、GSH-Px、SOD、CAT測定

小鼠肝臟組織用4 ℃生理鹽水清洗，濾紙擦干水漬后稱質(zhì)量，每只小鼠取50 mg左右組織，按1∶9的比例加入0.9%生理鹽水，F(xiàn)astPrep-24勻漿。3 500 rpm，4 ℃離心10 min后取上清液得10%的肝臟組織勻漿。按說明書測定肝臟組織勻漿中GSH、GSH-Px、SOD、CAT含量。

1.2.5 病理切片

1.2.6 Western blotting蛋白分析

采用Western blotting法測定小鼠肝臟中CYP450，Ⅱ相代謝酶SULT1A1、UGT1A6和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP2、P-gp的表達(dá)情況。稱取在-80 ℃凍存的小鼠肝臟80 mg左右，加入冰上預(yù)冷的NP40裂解液1 mL，操作與冰上進(jìn)行，用FastPrep-24勻漿，之后4 ℃，12 000 rpm離心30 min，分取上清液。BCA法測定蛋白濃度，將樣品的蛋白濃度調(diào)整到5 mg/mL，按4∶1的體積比加入5×loading buffer，100 ℃加熱5 min，冰上冷卻，離心，混勻，分裝，-80 ℃放置備用。另調(diào)整一份蛋白濃度為1 mg/mL的樣品，-80 ℃放置備用。

取出-80 ℃凍存的制備好的5 mg/mL蛋白樣品，100 ℃再次加熱5 min。冰上冷卻混勻。制膠、上樣5 μL、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗(GAPDH、CYP3A11、CYP1A2、CYP2E1、SULT1A1、P-gp)孵育、二抗孵育、顯影成像。顯影后將所得的蛋白質(zhì)條帶用Image Lab 5.1軟件分析。

取出-80 ℃凍存的制備好的1 mg/mL蛋白樣品，按照Simple Western兔抗檢測劑盒說明書操作流程測定CYP3A11、CYP2E1、MRP2、UGT1A6的蛋白表達(dá)水平(詳細(xì)條件見表1)。

表1 Western blotting一抗二抗列表Table 1 Description of primary and secondary antibodies for Western blotting

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用mean±SD在圖像上表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若符合用單因素方差分析(ANOVA)，采用最小顯著性差異法(LSD)檢驗(yàn)，方差不齊者采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 龍井茶多酚提取物中多酚含量

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.005 1x+0.041 5，r2=0.999 4，線性良好(見圖1)。通過計(jì)算得龍井茶多酚提取物中總多酚的含量為494.93 mg/kg。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of garlic acid

2.2 病理切片

在每個(gè)實(shí)驗(yàn)組HE染色的病理切片挑選典型圖片，通過分析，可以看出三個(gè)劑量的龍井茶多酚提取物對小鼠的肝臟不存在病理上的損傷(見圖2)。

圖2 小鼠肝臟病理學(xué)檢查Fig.2 Pathologic changes of liver tissues of mouse

2.3 血清ALT和AST含量

龍井茶多酚提取物對小鼠肝臟中ALT、AST的影響情況見圖3。相對于空白組，75 mg/kg的龍井茶多酚提取物能顯著性降低小鼠血清中ALT的水平，150 mg/kg的龍井茶多酚提取物能顯著性增加血清中AST的水平，其他劑量組沒有顯著性差異。

圖3 小鼠肝臟ALT和AST水平Fig.3 AST and ALT level in mouse liver注：與空白對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；下同。Note:Compared with control,*P < 0.05,** P < 0.01,***P < 0.001;The same below.

2.4 肝臟組織中GSH、GSH-Px、SOD和CAT含量

龍井茶多酚提取物對小鼠肝臟中生化指標(biāo)的影響見圖4。對于GSH，相對于對照組，三個(gè)劑量的龍井茶多酚提取物顯著性降低了肝臟內(nèi)的GSH水平，與劑量呈負(fù)相關(guān)(見圖4A)。對于GSH-Px，相對于對照組，三個(gè)劑量的龍井茶多酚提取物就能顯著性提高小鼠肝臟中GSH-Px的含量(見圖4B)。對于SOD，相對于對照組，龍井茶多酚提取物對其在肝臟中的含量沒有顯著性影響(見圖4C)。對于CAT，相對于對照組，37.5 mg/kg龍井茶多酚提取物能夠顯著性提高其在小鼠肝臟中的含量，但是75和150 mg/kg的劑量顯著性降低其在肝臟中的活性(見圖4D)。

圖4 肝臟組織中生物化學(xué)指標(biāo)含量Fig.4 Biochemistry makers content in liver tissue

2.5 龍井茶多酚提取物對CYP450的影響

龍井茶多酚提取物對CYP450的影響見圖5。對于CYP1A2，相對于對照組，三個(gè)劑量的龍井茶多酚提取物對小鼠肝臟中CYP1A2相對蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著性影響(見圖5A)；對于CYP2E1，相對于對照組，37.5和75 mg/kg龍井茶多酚提取物可以顯著性上調(diào)CYP2E1的蛋白表達(dá)水平，150 mg/kg龍井茶多酚提取物對該蛋白的相對表達(dá)水平?jīng)]有影響(見圖5B)。對于CYP3A11，相對于對照組，37.5 mg/kg龍井茶多酚提取物可以顯著性上調(diào)CYP3A11的蛋白表達(dá)水平(見圖5C)，75 mg/kg龍井茶多酚提取物對小鼠肝臟中CYP3A11相對蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著性影響，150 mg/kg龍井茶多酚提取物顯著性抑制CYP3A11的蛋白表達(dá)水平(見圖5C)。

圖5 小鼠肝臟中CYP450的相對蛋白表達(dá)水平Fig.5 Relative protein expression of CYP450 in mouse liver

2.6 龍井茶多酚提取物對Ⅱ相代謝酶的影響

龍井茶多酚提取物對Ⅱ相代謝酶的影響見圖6。對于SULT1A1，相對于對照組，對于37.5 mg/kg龍井茶多酚提取物能夠顯著性提高SULT1A1的相對蛋白表達(dá)水平，75和150 mg/kg龍井茶多酚提取物對該酶的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著性影響。對于UGT1A6，相對于對照組，37.5 mg/kg龍井茶多酚提取物能顯著性提高小鼠肝臟中UGT1A6的相對蛋白表達(dá)水平，75.5和150 mg/kg的劑量對該蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有顯著性影響。

圖6 小鼠肝臟中Ⅱ相代謝酶的相對蛋白表達(dá)水平Fig.6 Relative protein expression of phase Ⅱ enzymes in mouse liver

2.7 龍井茶多酚提取物對轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響

龍井茶多酚對小鼠肝臟中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響見圖7。對于MRP2，相對于對照組，75和150 mg/kg龍井茶多酚提取物可以顯著性提高其蛋白表達(dá)水平(見圖7A)。對于P-gp，相對于對照組，37.5和150 mg/kg龍井茶多酚提取物均顯著性抑制P-gp的蛋白相對表達(dá)水平，75 mg/kg龍井茶多酚提取物對P-gp的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著性影響(見圖7B)。

圖7 小鼠肝臟中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相對蛋白表達(dá)水平Fig.7 Relative protein expression of transporters in mouse liver

3 討論與結(jié)論

ALT和AST是衡量肝臟功能是否發(fā)生異常的兩個(gè)重要指標(biāo)。通常情況下，ALT和AST主要存在于肝臟中，在血液中的含量極低。但是當(dāng)肝臟功能發(fā)生異常時(shí)，ALT和AST就會從肝臟中轉(zhuǎn)移至血液中，導(dǎo)致血液中ALT、AST含量升高，活性增加。從血清中ALT、AST的活性變化情況，可以知道肝臟的健康情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對于空白組，75 mg/kg的龍井茶多酚提取物能顯著性降低小鼠血清中ALT的水平，150 mg/kg的龍井茶多酚提取物能顯著性增加血清中AST的水平，其他劑量組沒有顯著性差異。但是在臨床上，在ALT正常的情況下，單純的AST升高并不能說明肝臟存在損傷，同時(shí)病理切片結(jié)果分析顯示龍井茶多酚對小鼠肝臟不存在病理上的傷害。

人體細(xì)胞、組織受到氧化脅迫是癌癥、心血管疾病等諸多疾病的誘因之一[14,15]。為保護(hù)機(jī)體免受過氧化的損傷，細(xì)胞有一套完善的抗氧化酶防御酶系。主要包括SOD、CAT、GSH、GSH-Px等。其中SOD把超氧陰離子轉(zhuǎn)換為H2O2，GSH-Px和CAT將H2O2催化成H2O，從而將毒性超氧陰離子和H2O2轉(zhuǎn)換成無毒的H2O[16]。茶多酚是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑，富含-OH基團(tuán)，具有很好的體內(nèi)外抗氧化活性，對氧化應(yīng)激具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用。龍井茶多酚提取物對小鼠肝臟內(nèi)SOD活性沒有顯著性影響，但是可以顯著性增加GSH-Px的活性，37.5 mg/kg龍井茶多酚提取物可以顯著性增加CAT在肝臟中的活性?？梢钥闯鳊埦瓒喾犹崛∥锬芡ㄟ^調(diào)節(jié)CAT和GSH-Px在小鼠肝臟中的含量來增加小鼠肝臟抵抗氧化應(yīng)激能力。對于GSH，隨著龍井茶多酚提取物給予的劑量的增加，其肝臟內(nèi)的含量下降，可能是由于龍井茶多酚作為提取物，其中的其他成分造成了GSH的消耗。

CYP450參與內(nèi)/外源性物質(zhì)的代謝，包括藥物、環(huán)境化合物等，具有個(gè)體差異大，容易受到外源性物質(zhì)的影響的特點(diǎn)[17]。37.5 mg/kg龍井茶多酚提取物能顯著性提高CYP2E1/3A11兩個(gè)亞型在小鼠肝臟中的蛋白表達(dá)水平。說明低劑量的龍井茶多酚提取物對CYP450有一定的誘導(dǎo)作用。Ⅱ相代謝酶UGTs和SULTs主要分布在肝臟，將內(nèi)/外源性物質(zhì)代謝為易于排出的水溶性物質(zhì)[18]。37.5 mg/kg的龍井茶多酚提取物可以顯著性增加UGT1A6和SULT1A1在小鼠肝臟中的蛋白表達(dá)水平，而75和150 mg/kg龍井茶多酚提取物對這兩個(gè)酶的表達(dá)情況沒有顯著性影響。說明低劑量的龍井茶多酚提取物對Ⅱ相代謝酶有一定的誘導(dǎo)作用。MRP2主要分布在人體肝細(xì)胞基底膜上，它能在阻塞性黃疸中調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的損傷，參與細(xì)胞內(nèi)外多種毒性復(fù)合物的轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)整細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的重分布、促進(jìn)膽汁的分泌，增加膽汁酸鹽的脂溶性。75和150 mg/kg的龍井茶多酚提取物可以顯著性提高小鼠肝臟內(nèi)MRP2的蛋白表達(dá)水平，有潛在的保護(hù)肝細(xì)胞的作用。P-gp是一個(gè)比較常見的保護(hù)細(xì)胞免受外來有害分子入侵的分子泵，它位于細(xì)胞膜上，能與藥物結(jié)合，同時(shí)具有ATP酶活性，能夠分解ATP供能，將細(xì)胞內(nèi)藥物泵出細(xì)胞外，減低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性[19]。37.5和150 mg/kg的龍井茶多酚提取物對P-gp的蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)下調(diào)作用，75 mg/kg的龍井茶多酚提取物對P-gp的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著性影響，這可能是由于龍井茶多酚的代謝產(chǎn)物或者其本身會經(jīng)P-gp排出。黃希希等人的綜述確定茶多酚中EGCG和藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體之間存在相互作用，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步確認(rèn)。

通過本研究可以看出，龍井茶多酚能夠加強(qiáng)小鼠肝臟內(nèi)的氧化防御系統(tǒng)功能，幫助機(jī)體抵御內(nèi)/外源性氧化應(yīng)激。低劑量的龍井茶多酚對小鼠肝臟內(nèi)的Ⅰ相代謝酶、Ⅱ相代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都有一定的誘導(dǎo)作用?？寡趸赶怠ⅱ蛳啻x酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)節(jié)涉及Nrf2-Keap1通路[20,21]。而CYP450酶系受雄烷受體(CAR)和孕烷X受體(PXR)的調(diào)節(jié)，龍井茶多酚對這些可能涉及的通路的影響值得更深入的研究[22,23]。