李逸飛，馬婉婷，曹 園，陳玉根，吳信華

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 江蘇省中醫(yī)院，南京 210029

藥食同源根植于中醫(yī)藥文化，指藥品和食品均來源于自然界，在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，以初生和次生代謝產(chǎn)物為物質(zhì)基礎(chǔ)，起調(diào)養(yǎng)、康復(fù)、保健作用。藥食同源體現(xiàn)中醫(yī)藥獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在疾病治療中起協(xié)同作用、在治未病和疾病康復(fù)中起重要作用。在對(duì)傳統(tǒng)藥食兩用物質(zhì)的安全性充分評(píng)估的基礎(chǔ)上，我國制定了《既是食品又是藥品的物品名單》(以下簡(jiǎn)稱《名單》)，收載93種具有傳統(tǒng)食用習(xí)慣，且列入國家中藥材標(biāo)準(zhǔn)(包括《中華人民共和國藥典》及相關(guān)中藥材標(biāo)準(zhǔn))的中藥。現(xiàn)階段，對(duì)藥食同源物質(zhì)的開發(fā)亟需用科學(xué)理論闡明其功效及分子機(jī)制，而藥食同源物質(zhì)起效和緩，不適合采用化學(xué)藥物-靶標(biāo)的研究思路，腸道微生態(tài)為我們提供了全新視角。

人體的胃腸道，富集著數(shù)以億萬計(jì)的微生物群，這些微生物所編碼的基因組是人體本身基因的50～100倍，被譽(yù)為人體“第二基因組”。腸道菌群作為人體的“特殊器官”，與人體互利共生，在人體物質(zhì)、能量代謝，神經(jīng)、免疫調(diào)控，以及抵御病源微生物的侵入等方面發(fā)揮重要作用。大量研究表明，菌群失調(diào)(菌群結(jié)構(gòu)的改變)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如癌癥、感染性疾病、心血管疾病、精神系統(tǒng)疾病等。藥食同源物質(zhì)通過調(diào)節(jié)腸道菌群，發(fā)揮養(yǎng)生保健和防病治病的作用。

烏梅為薔薇科植物梅Prunusmume(Sieb.) Sieb.et Zucc.的干燥近成熟果實(shí)，經(jīng)熏制或烘制等方法加工而成。烏梅有悠久的藥食歷史，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品；為《名單》收載品種，廣泛融入日常飲食和保健，在日本更甚，有“喝早茶的時(shí)候請(qǐng)享用梅干”的俗語。本品性酸、澀、平，歸肝、脾、肺、大腸經(jīng)，具有斂肺、澀腸、生津、安蛔等功效。研究表明，烏梅富含有機(jī)酸、酚酸、黃酮、萜類和甾體等成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)烏梅具有抑菌、鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)靜催眠及抗驚厥、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理作用[1,2]。本研究構(gòu)建廣譜抗生素誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群紊亂模型，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)烏梅干預(yù)前后小鼠的腸道菌群進(jìn)行16SrRNA基因測(cè)序，并檢測(cè)體質(zhì)量和炎性因子改變，研究烏梅對(duì)抗生素所致腸道菌群失調(diào)的調(diào)節(jié)作用，從腸道微生態(tài)的角度為烏梅的藥食應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠40只，體重18～22 g，雄性，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0007。于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院基礎(chǔ)藥理室SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)SYXK(蘇)2017-0069)，溫度22±2 ℃，濕度55%±10%，12 h明暗交替。遵循南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定和要求。

1.2 試劑與儀器

硫酸慶大霉素(批號(hào)EZ2811A396，德國BioFROX公司)；頭孢噻肟鈉(批號(hào)E612BA0041，中國BBI生命科學(xué)有限公司)；MetaVxTM文庫構(gòu)建試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)；純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)；Qubit 2.0 Fluorometer(Invitrogen，Carlsbad，CA)；Illumina MiSeq(Illumina，San Diego，CA，USA)。

1.3 動(dòng)物分組與給藥

40只ICR小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(blank group，B)、模型組(model group，M)、烏梅高劑量組(high-dose group，H)、烏梅中劑量組(medium-dose group，Me)、烏梅低劑量組(low-dose group，L)，每組8只。B組：生理鹽水0.2 mL/次，2次/天；M組：抗生素混合溶液(硫酸慶大霉素7.5 mg/次+頭孢噻肟鈉30 mg/次)0.2 mL/次，2次/天；烏梅L、Me、H組：劑量分別為0.78、1.56、7.8 g/kg/d的烏梅水煎液(折合臨床最高劑量的0.5、1、5倍)，0.2 mL/次，2次/天。

每組均灌胃給藥，M組連續(xù)給生理鹽水9天，其余組預(yù)防給藥9天，第10天開始同時(shí)給予抗生素混合溶液，于第15天早上稱重、無菌取其糞便、摘眼球取血并脫頸處死。每天給藥前觀察糞便形態(tài)。

1.4 取樣和檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 藥物干預(yù)對(duì)小鼠體重的影響

于第0、3、7、11、15天分別稱體重，記錄重量。

1.4.2 藥物干預(yù)對(duì)小鼠炎性因子的影響

末次給藥后各組小鼠禁食不禁水，無菌收集小鼠新鮮糞便。迅速裝入無菌凍存管中轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱，備用。

小鼠眼眶取血，室溫放置2 h再離心，3 000 rpm，10 min，取上清液即得，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫谎逯心[瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)均采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 HE染色及組織病理

小鼠取血后處死，取出心、肝、脾、肺、腎、腸組織，用生理鹽水洗凈表面浮血，濾紙吸干，置于福爾馬林固定。組織病理學(xué)檢查，將組織從福爾馬林溶液中取出，脫水，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色、脫水、二甲苯透明，以中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織并拍攝。由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師閱片。

1.4.4 腸道菌群Illumina MiSeq測(cè)序分析

本實(shí)驗(yàn)菌群結(jié)構(gòu)的高通量測(cè)序和分析由蘇州金唯智科技有限公司完成。

取小鼠糞便提取DNA，提取方法參照Qubit dsDNA Assay Kit(Life Technologies，Q328520)試劑盒說明書。提取得到的DNA樣品經(jīng)Qubit 2.0 Fluorometer(Invitrogen，Carlsbad，CA)檢測(cè)濃度，使用MetaVxTM文庫構(gòu)建試劑盒(GENEWIZ，Inc.，South Plainfield，NJ，USA)構(gòu)建測(cè)序文庫。

30～50 ng DNA為模板，PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA上V3～V4可變區(qū)，上游引物包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列，下游引物包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”序列。使用Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)檢測(cè)文庫質(zhì)量，并進(jìn)行Qubit定量。DNA文庫混合后，上機(jī)測(cè)序，由MiSeq Control Software(MCS)讀取序列信息。雙端序列去雜，拼接，去除嵌合體序列，使用Vsearch(1.9.6)進(jìn)行序列聚類(序列相似性設(shè)為97%)，參考Silva132數(shù)據(jù)庫，得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種信息，物種比對(duì)注釋使用RDP classifier軟件，保留置信區(qū)間大于0.7的注釋結(jié)果。對(duì)測(cè)得的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行分類單元聚類、OTUs豐度、alpha / beta多樣性分析。采用LEfSe分析，比較抗生素及不同劑量烏梅引起的腸道菌群豐度在各物種分類水平上的差異。利用PICRUSt軟件將測(cè)序得到的菌群組成“映射”到Greengenes數(shù)據(jù)庫中，對(duì)菌群功能和代謝途徑進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 藥物干預(yù)對(duì)小鼠體重的影響

于第0、3、7、11、15天分別稱量小鼠體重，并記錄，結(jié)果(圖1)顯示抗生素可顯著增加小鼠的體重，而中劑量和高劑量烏梅可以顯著降低小鼠體重，提示烏梅有減重的可能。

圖1 烏梅對(duì)小鼠體重的影響Fig.1 The effect of Mume Fructus on the weight of mice

2.2 藥物干預(yù)對(duì)小鼠系統(tǒng)炎癥水平的影響

采用血清多種細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)反映系統(tǒng)炎癥水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗生素引起小鼠血清TNF-α極顯著上升，對(duì)IL-1β、IL-6有下調(diào)作用，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中劑量烏梅可以調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β、IL-6至正常水平，低、高劑量烏梅對(duì)細(xì)胞因子的改善不明顯。

表1 烏梅對(duì)小鼠血清中TNF-α、1L-6和1L-1β水平的影響Table 1 Effect of Mume Fructus on TNF-α,1L-6 and 1L-1β in the serum of mice s,n=8)

2.3 HE染色及組織病理觀察

作為藥食同源物質(zhì)，烏梅長期用于日常飲食保健，其安全性已得到證實(shí)；但臨床提示長期、大量服用烏梅，會(huì)引起病人胃部不適。為了研究服用烏梅對(duì)腸黏膜的影響及服用高劑量烏梅的初步安全性，將灌胃不同劑量烏梅提取物的小鼠腸黏膜及高劑量烏梅提取物的小鼠心、肝、脾、肺、腎、胃HE染色(見圖2)，由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師閱片。結(jié)果顯示，臟器幾乎無病變；實(shí)驗(yàn)劑量的抗生素沒有引起腸粘膜的損傷，高、中、低劑量的烏梅也沒有引起腸黏膜損傷，粘膜層及粘膜下層都很完整；小鼠灌胃高劑量烏梅，心、肝、腎、脾正常；胃輕度水腫，仍屬正常范圍；肺間質(zhì)少量炎性細(xì)胞，肺泡腔擴(kuò)張，肺泡壁塌陷，可見部分水腫。病理切片的結(jié)果和血清TNF-α上升，提示高劑量烏梅對(duì)胃有刺激，有可能引起機(jī)體慢性炎癥，這與臨床長期、大量服用烏梅病人胃部不適相吻合。

圖2 組織病理切片HE染色圖(×40)Fig.2 Pathological sections of tissues HE staining (×40)注：a:B組小腸；b:M組小腸；c:L組小腸；d:Me組小腸；d:H組小腸；f:H組心；g:H組肝；h:H組脾；i:H組肺；j:H組腎；k:H組胃。紅色圈為肺泡腔擴(kuò)張，肺泡壁塌陷；紅色箭頭1為水腫；紅色箭頭2為炎性細(xì)胞(藍(lán)紫色)。Note: a: The intestinal tissue of B; b: The intestinal tissue of M; c: The intestinal tissue of L; d: The intestinal tissue of Me; e: The intestinal tissue of H group; f: The heart tissue of H; g: The liver tissue of H; h: The spleen tissue of H; i: The lung tissue of H; j: The kidney tissue of H; k: The stomach tissue of H.Red circle: The expanded alveolar cavity and collapsed alveolar compartment; Red arrow 1: Edema; Red arrow 2: Inflammatory cells (blue-purple).

2.4 烏梅對(duì)抗生素誘導(dǎo)腸道菌群紊亂的調(diào)節(jié)作用

2.4.1 腸道菌群的多樣性分析

采用α和β多樣性分析，描述和評(píng)價(jià)菌群的整體結(jié)構(gòu)。α多樣性反映的是單個(gè)樣品內(nèi)部的物種多樣性。稀釋曲線趨于平緩，可以認(rèn)為測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種。圖3顯示，所有樣本在測(cè)序量1 000左右時(shí)出現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，隨后進(jìn)入平緩期，說明本次測(cè)序深度充分。

圖3 小鼠腸道菌群的稀釋曲線Fig.3 Rarefaction curves of murine gut microbiota

Ace與Chao1指數(shù)反映菌群物種的豐富度；Shannon及Simpson指數(shù)是均勻度和豐富度的綜合指標(biāo)。由表2可知，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠的腸道菌群豐富度指數(shù)(Ace和Chao1)極顯著升高(P<0.01)，多樣性指數(shù)(Shannon和Simpson指數(shù))未發(fā)生明顯改變；中劑量和高劑量烏梅可以逆轉(zhuǎn)抗生素引起的小鼠的腸道菌群豐富度(Ace和Chao1)的變化(P<0.05)，多樣性指數(shù)(Shannon Wiener和Simpson指數(shù))未發(fā)生明顯改變。Chao1是度量物種豐富度的指標(biāo)，它和豐度、均勻度無關(guān)，但是它對(duì)稀有的物種很敏感，由此可知，抗生素引起小鼠腸道菌群的紊亂，大量正常狀態(tài)下不生長的菌開始定植、生長，包括大量致病菌。

表2 各組小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)Table 2 Intestinal microbial diversity indexes of respective groups of mice s，n=8)

β多樣性反映的是不同分組樣本的差異，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用PCA分析(principal component analysis，主成分分析)、PCoA分析(principal co-ordinates analysis，主坐標(biāo)分析)和NMDS分析(nonmetric multidimensional scaling，非度量多維尺度分析)進(jìn)行分析。PCA分析根據(jù)OTU豐度降維找主要影響因素，而PCoA和NMDS分析是基于不同算法的距離矩陣進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，模型組和空白對(duì)照組小鼠菌群結(jié)構(gòu)差異明顯，不同劑量烏梅可以回調(diào)(圖4A、B、C)。

圖4 小鼠腸道菌群主成分(A)、主坐標(biāo)(B)和非度量多維尺度分析(C)Fig.4 4 PCA (A),PCoA (B) and NMDS (C) analysis of murine gut microbiota

2.4.2 腸道菌群的結(jié)構(gòu)分析

腸道微生物群落結(jié)構(gòu)直方圖(圖5)揭示了微生物種類及其相對(duì)豐度。在門水平上，空白對(duì)照組厚壁菌門和擬桿菌門是最主要的物種，豐度比例達(dá)到90%以上，其中厚壁菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度比例分別為41.87%和56.69%?？股仫@著升高小鼠腸道變形菌門(P<0.001)和放線菌門(P<0.01)的相對(duì)豐度，而擬桿菌門(P<0.01)豐度及擬桿菌門/厚壁菌門的比例顯著降低。

圖5 烏梅對(duì)門(A)和屬(B)水平小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 The effects of MF on the relative abundance of murine gut microbiota at phylum (A) and genus (B) level

在屬水平上，與空白對(duì)照組相比，抗生素顯著增加了Clostridium_sensu_stricto_1(P=0.003)Halomonas(P=0.011)、Weissella(P=0.001)、Streptococcus(P=0.000)，Staphylococcus(P=0.001)、Enterococcus(P=0.002)、Curtobacterium(P=0.001)、Enhydrobacter(P=0.035)、Collinsella(P=0.019)、Bradyrhizobium(P=0.020)、Enterobacter(P=0.035)的相對(duì)豐度，顯著降低Lactobacillus(P=0.037)、Faecalibaculum(P=0.041)、Bifidobacterium(P=0.001)、Desulfovibrio(P=0.001)、Roseburia(P=0.001)、Alloprevotella(P=0.001)，Ruminiclostridium_9(P=0.015)、Ruminococcaceae_UCG-014(P=0.003)、Parabacteroides(P=0.033)、Parasutterella(P=0.015)、Lachnoclostridium(P=0.005)、Akkermansia(P=0.015)，Marvinbryantia(P=0.025)、Ruminococcaceae_UCG-005(P=0.043)。而烏梅可以改善抗生素引起的菌群紊亂的狀況。在門水平上，中、低劑量的烏梅顯著降低變形菌門的相對(duì)豐度。在屬水平上，中、低劑量的烏梅顯著上調(diào)Lactobacillus(P=0.001，P=0.000)和Faecalibaculum(P=0.005，P=0.038)，高、低劑量的烏梅顯著上調(diào)Bifidobacterium(P=0.000，P=0.000)和Blautia(P=0.049，P=0.000)的相對(duì)豐度。

2.4.3 腸道菌群的差異性分析

為了確定各組之間具有顯著差異的細(xì)菌類群，在組間進(jìn)行了LEfSe(linear discriminate analysis size effect)分析(圖6)，尋找組間在豐度上有顯著差異的物種。LDA值分布柱狀圖中展示了組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker。結(jié)果顯示，LDA score大于4的分類群：空白對(duì)照組12個(gè)，分別為擬桿菌綱、擬桿菌目、擬桿菌門、毛螺桿菌科、擬桿菌屬、乳桿菌目、乳桿菌科等；模型組7個(gè)，分別為立克次氏體目、生氧光細(xì)菌綱、藍(lán)細(xì)菌門、梭菌科、梭菌屬等；低劑量烏梅組7個(gè)，分別為厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目、消化鏈球菌科等；中劑量烏梅組1個(gè)，芽孢桿菌目；高劑量組8個(gè)，分別為變形桿菌門、α-變形桿菌綱、根瘤菌目、根瘤菌科、柄桿菌目、柄桿菌科、β-變形桿菌綱、γ-變形桿菌綱。

圖6 不同樣品腸道菌群的LEfSe分析圖Fig.6 LEfSe analysis of gut microbiota community for all samples

2.4.4 PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析

PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析基于Greengenes數(shù)據(jù)庫注釋的16S測(cè)序數(shù)據(jù)。腸道菌群預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度較高，可以達(dá)到85%-90%以上。

通過對(duì)KEGG數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)進(jìn)行比對(duì)，共獲得7類生物代謝通路功能分析(一級(jí)功能層)：人類疾病(human diseases)、代謝(metabolism)、遺傳信息處理(genetic information processing)、有機(jī)系統(tǒng)(organismal systems)、細(xì)胞過程(cellular processes)和環(huán)境信息處理(environmental information processing)。模型組的預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)在人類疾病、遺傳信息處理、有機(jī)系統(tǒng)和環(huán)境信息處理4個(gè)一級(jí)功能層，較空白對(duì)照組增高，預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)相應(yīng)增加；而代謝、未分類、未知這3個(gè)一級(jí)功能層，較空白對(duì)照組減少。中、低劑量的烏梅可以逆轉(zhuǎn)這些過程。進(jìn)一步對(duì)預(yù)測(cè)基因二級(jí)功能層進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其由細(xì)胞過程和信號(hào)(cellular processes and signaling)、遺傳信息處理(genetic information processing)、癌癥(cancers)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(endocrine system)、次生產(chǎn)物代謝的生物合成(biosynthesis of other secondary metabolites)、轉(zhuǎn)錄(transcription)、細(xì)胞生長和死亡(cell growthand death)等30個(gè)子功能組成(圖5)。對(duì)基因拷貝數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)低、中劑量烏梅組可以逆轉(zhuǎn)抗生素引起的癌癥(cancers)、感染性疾病(infectious diseases)、神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerative diseases)和能量代謝4個(gè)子功能預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)的顯著升高。

3 討論

烏梅藥食歷史悠久，集醫(yī)療、保健、養(yǎng)生于一體。《本草從新》記載其可澀腸斂肺，止血涌痰，消腫解毒，生津止渴，治久嗽瀉痢，血痢尤良。臨床專家辨證靈活化裁運(yùn)用含烏梅的方劑，治療肺系疾病如哮喘、過敏性鼻炎，胃腸疾病如慢性胃炎、頑固性腹瀉、炎癥性腸病、腸道惡性腫瘤，神經(jīng)系統(tǒng)疾病如頭痛、眩暈、失眠、帕金森病，以及代謝性疾病如糖尿病等[3-7]。作為藥食同源中藥，烏梅兼具營養(yǎng)與“扶正”作用，安全性高，日常飯食、茶飲、酒水中都有烏梅的身影。

圖7 不同樣品功能預(yù)測(cè)熱圖(二級(jí)功能層)Fig.7 Heatmap of gut miocrobial function prediction for all samples (hierarchy level 2)

腸道微生態(tài)與中醫(yī)學(xué)都強(qiáng)調(diào)平衡，一旦失調(diào)，則需“扶正”使之恢復(fù)平衡。本研究以臨床常聯(lián)用的廣譜抗生素—硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉灌胃造成小鼠腸道菌群失調(diào)模型(造模劑量約為人臨床最大用量的10倍)[8]，研究烏梅對(duì)菌群失調(diào)的調(diào)節(jié)作用，探討其作為微生態(tài)調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于臨床和養(yǎng)生保健的機(jī)制。通過對(duì)腸道菌群的結(jié)構(gòu)分析和對(duì)炎癥因子的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)烏梅可改善抗生素引起的菌群紊亂的狀況，并且調(diào)節(jié)炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6至正常水平。

健康人腸道通常缺氧，菌群以厭氧菌為主，致病性的兼性厭氧菌被壓制；許多疾病狀態(tài)下，兼性厭氧菌大量繁殖，標(biāo)志著腸道菌群失調(diào)。代謝紊亂、免疫失調(diào)期間，宿主對(duì)腸道生態(tài)系統(tǒng)的控制受損，兼性厭氧菌群轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)勢(shì)菌群，以變形菌門(含有許多條件致病菌)的增多為標(biāo)志；有學(xué)者提出以變形菌門擴(kuò)增作為腸道上皮功能障礙的診斷特征，和非傳染性疾病(如肥胖、哮喘等)的潛在生物標(biāo)志物[9]。2型糖尿病、炎癥性腸病(IBD)、精神疾病患者及多種呼吸道疾病中，均觀察到變形菌門高表達(dá)[10-12]。模型組小鼠變形菌門的相對(duì)豐度顯著升高，中、低劑量的烏梅顯著降低變形菌門的相對(duì)豐度，這與烏梅澀腸斂肺，生津止渴的功效相一致。

研究發(fā)現(xiàn)無菌小鼠腸道內(nèi)定殖的羅伊氏乳桿菌、卷曲乳桿菌等通過粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落(GM-CSF)刺激特定的免疫功能，從而抵御肺部感染[13]。動(dòng)物雙歧桿菌通過幾種特定的代謝分子介導(dǎo)無菌小鼠抗流感作用，或許能用于預(yù)防流感和作為流感預(yù)后的標(biāo)志物[14]。小鼠腸道乳桿菌和雙歧桿菌的豐度被證實(shí)與瘧疾感染的嚴(yán)重程度相關(guān)，具有調(diào)節(jié)腸道菌群降低感染的潛在價(jià)值[15]。DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠移植乳桿菌屬細(xì)菌，可逆轉(zhuǎn)DSS造成的結(jié)腸縮短，減輕炎癥、增加結(jié)腸干細(xì)胞數(shù)量[16]。一項(xiàng)納入17名肥胖個(gè)體、22名肥胖且伴隨2型糖尿病患者，及27名健康個(gè)體的研究提示雙歧桿菌屬細(xì)菌可能成為2型糖尿病和肥胖疾病發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志物[17]。一項(xiàng)納入1 001名20～76歲日本受試者的橫斷面研究顯示，Blautia(布勞特氏菌屬)與內(nèi)臟脂肪面積(VFA)呈顯著負(fù)相關(guān)[18]。肥胖及肥胖+胰島素抵抗兒童的糞便中Blautia菌屬顯著減少，而炎癥因子卻升高，體外單核細(xì)胞培養(yǎng)物中，Blautia屬的特定物種表現(xiàn)出抗炎作用[19]。一項(xiàng)納入103名馬來西亞成年人的隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照試驗(yàn)顯示，補(bǔ)充植物乳桿菌P8可顯著緩解壓力、焦慮，并降低血漿中的炎癥因子，提升記憶及認(rèn)知能力[20]。而在結(jié)直腸癌小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)aecalibaculumrodentium可通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸發(fā)揮抗腫瘤作用[21]。

本研究顯示，中、低劑量的烏梅在屬水平上，顯著上調(diào)Lactobacillus和Faecalibaculum，高、低劑量的烏梅顯著上調(diào)Bifidobacterium和Blautia的相對(duì)豐度。據(jù)此，我們推測(cè)烏梅介導(dǎo)Lactobacillus、Bifidobacterium、Blautia和Faecalibaculum等益生菌，通過肺-腸軸、腸-腦軸發(fā)揮對(duì)肺系疾病、胃腸道炎癥和腫瘤，以及代謝疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治作用，這也與PICRUSt的預(yù)測(cè)結(jié)果相符合。

本研究通過檢測(cè)炎性因子研究烏梅對(duì)慢性炎癥的改善作用。TNF-α啟動(dòng)炎癥過程，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)繼發(fā)性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，不僅在感染與炎癥反應(yīng)中起核心作用，其功能還涉及腫瘤細(xì)胞的生長、抑制和組織損傷等；模型組小鼠血清的TNF-α極顯著上升，恰好與PICRUSt功能預(yù)測(cè)相吻合—抗生素引起模型小鼠癌癥、感染性疾病、神經(jīng)退行性疾病等子功能的基因拷貝數(shù)顯著升高。血漿中的TNF-α受內(nèi)臟的脂肪含量影響，而抗生素引起小鼠體重顯著上升可能是小鼠TNF-α顯著上調(diào)的誘因之一。IL-6和IL-1β由TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生，介導(dǎo)炎性反應(yīng)急性期，模型組小鼠IL-1β、IL-6雖下降，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，病理切片亦顯示本實(shí)驗(yàn)中抗生素并未引起小鼠腸黏膜損傷，說明本實(shí)驗(yàn)中抗生素引起炎癥程度較輕。對(duì)基因拷貝數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)低、中劑量烏梅可以逆轉(zhuǎn)抗生素引起的癌癥、感染性疾病、神經(jīng)退行性疾病和能量代謝4個(gè)子功能預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)的顯著升高。但是低劑量烏梅對(duì)炎性因子的改善作用并不明顯，僅中劑量烏梅調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β、IL-6至正常水平，并有減重的效果。烏梅有抗菌的作用，炎性因子的檢測(cè)結(jié)果亦支持烏梅通過干擾致病菌在腸道定植抑制其生長，上調(diào)益生菌發(fā)揮抗炎作用。高劑量烏梅組病理切片顯示肺和胃組織有輕度水腫，小鼠血清TNF-α水平亦較高，可能因?yàn)闉趺犯缓袡C(jī)酸，劑量過大對(duì)胃有刺激性，引起機(jī)體慢性炎癥，提醒我們?yōu)趺冯m為藥食同源物質(zhì)，大劑量食用也有危害。

綜上所述，本研究從腸道微生態(tài)的視角探索烏梅發(fā)揮藥食功效的作用機(jī)制，為烏梅的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，并揭示其作為腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑產(chǎn)品前景，為進(jìn)一步的研究開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。