林能鋒，潘瀅，許斌福，龔暉，曾紅

（1.大黃魚育種國家重點(diǎn)實驗室，寧德富發(fā)水產(chǎn)有限公司，福建 寧德 352100；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003；3.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院南方海洋研究院，福建 福州 350007）

魚類腸道微生物群落與其食物消化、營養(yǎng)代謝、發(fā)育及機(jī)體免疫等重要的生理特征密切相關(guān)[1-5]。魚類腸道細(xì)菌的多樣性受宿主遺傳發(fā)育、食性及水環(huán)境等多種內(nèi)外因素的影響[6]。更好地了解腸道菌群與魚類健康之間的相互作用是水產(chǎn)養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵之一。

花鱸（Lateolabrax maculatus）隸屬于鱸形目（Perciformes），花鱸屬（Lateolabrax），分布于中國沿海、日本及朝鮮[7]，2019年我國養(yǎng)殖產(chǎn)量180 173 t[8]，是沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖魚類種類。研究表明，在正常生理狀況下，花鱸腸道菌群主要以變形菌門、厚壁菌門、放線菌門及擬桿菌門細(xì)菌為主要類群[9-12]。張琛等[10]對浙江舟山網(wǎng)箱養(yǎng)殖花鱸研究發(fā)現(xiàn)，其腸道菌群中厚壁菌門細(xì)菌占比高達(dá)71.6%，而在另外一些學(xué)者的研究中，變形菌門細(xì)菌則是花鱸腸道菌群中的優(yōu)勢類群[9，11-12]。Clements等[13]認(rèn)為對魚類腸道微生物群落功能的研究必須將宿主所處的生態(tài)環(huán)境和宿主魚類生理狀況相聯(lián)系。在上述花鱸腸道菌群的研究中，花鱸的養(yǎng)殖環(huán)境（地域、水溫）和投喂餌料種類存在較大差異，從而反映出其腸道菌群的結(jié)構(gòu)也有著明顯的不同。因此，有必要對不同養(yǎng)殖條件下花鱸腸道菌群的多樣性進(jìn)行研究，以期對花鱸腸道菌群在不同環(huán)境及養(yǎng)殖方式的適應(yīng)性變化方面有更深入的了解。

在正常腸道微生態(tài)平衡的條件下，有益微生物菌群定植于腸黏膜，形成非特異性的菌膜屏障，抑制病原菌在腸壁內(nèi)定植[14-16]。同時，腸道微生物與宿主在腸道黏膜表面的交流促進(jìn)了免疫系統(tǒng)的建立和發(fā)展，成為重要的免疫屏障[17]。因此，魚類腸壁定植菌的研究可對魚類的健康及病害防治提供重要參考。潘艷艷等[9]探討了饑餓狀態(tài)對花鱸腸壁菌群的影響，但由于技術(shù)條件的制約，對正常養(yǎng)殖狀態(tài)下腸壁定植菌的復(fù)雜性的分析還顯不足。

現(xiàn)分析了福建寧德三都澳海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖花鱸腸道內(nèi)容物及腸壁菌群的多樣性特征,目的是揭示近岸網(wǎng)箱養(yǎng)殖條件下花鱸腸道細(xì)菌多樣性,并與相關(guān)研究進(jìn)行比較，以充實花鱸腸道菌群的研究數(shù)據(jù)，為花鱸的病害防治及開發(fā)功能性飼料添加劑提供更多的科學(xué)依據(jù)。

1 研究方法

1.1 實驗樣品

花鱸（L.maculatus）商品成魚采自福建寧德三都澳大灣村養(yǎng)殖網(wǎng)箱。采樣時間為2017年9月，養(yǎng)殖海區(qū)表層水溫25℃，海水pH值為8.0，鹽度26.8。投喂冰鮮雜魚糜。養(yǎng)殖花鱸攝食正常，采樣前一個月內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯的病害，亦未投喂藥物。共采樣9尾魚，平均體質(zhì)量（244±12）g，隨機(jī)分為3個平行組，每組3尾。

活魚用MS222麻醉，魚體表面用70%酒精進(jìn)行體表消毒，在超凈工作臺內(nèi)以無菌解剖剪剪取采樣魚的中、后腸，以無菌眼科鑷輕輕擠出腸道內(nèi)容物，每組3尾魚的腸道內(nèi)容物混勻成一個腸道內(nèi)容物樣品。

無菌注射器吸取無菌生理鹽水沖洗上述腸道樣品的內(nèi)壁，直到無肉眼可見腸道內(nèi)容物洗出，將腸道剪碎混勻，3尾魚的腸道組成一個魚腸壁樣品。上述樣品采樣后均快速放入液氮中運(yùn)回實驗室，并保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴(kuò)增及16SrDNA高通量測序

腸道微生物樣本DNA用E.Z.N.A.stool DNA試劑盒（Omega Biotek,Norcross,GA,U.S.）提取。提取得到的DNA樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和分光光度法（260 nm/280 nm）進(jìn)行質(zhì)量檢測。檢測合格后，將樣品于-20℃保存?zhèn)溆谩?6SrRNA基因V3-V4區(qū)的擴(kuò)增引物序列為341F：CCTACGGGNG GCWGCAG；806R：GGACTACHVGGGTATCTAAT，引物具有8堿基的特異性barcode以區(qū)別不同樣品。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)解鏈95℃2 min；98℃解鏈10 s，62℃退火30 s，68℃延伸30 s，共進(jìn)行27個循環(huán)；68℃延伸10 min。PCR反應(yīng)體系為：5μL 10×KOD緩沖液，5μL 2.5 mmol/L dNTPs，引物（5μmol/L）各1.5μL，1μL KOD DNA聚合酶，模板DNA100 ng，反應(yīng)總體積50μL。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增后樣品委托廣州基迪奧生物科技有限公司于Illumina Hiseq 2500平臺（PE250）測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)引物上barcode序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品測序數(shù)據(jù)，利用FLASH Version 1.2.11及Qiime Version1.9.1軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、拼接，并利用數(shù)據(jù)庫（Gold database）比對（UCHIME Algorithm）檢測并去除嵌合體序列，利用Mothur軟件包對tag序列進(jìn)行了去冗余處理，從中挑選出unique tag序列。用Uparse軟件（Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/）對所有樣品的全部Effective Tags序列聚類，以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為可操作分類單元OTUs，計算出每個OTU在各個樣品中的Tags絕對豐度和相對信息。樣品均一化值（cutoff=20 351），以處理后的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)進(jìn)行多樣性分析。物種的注釋基于SILVA數(shù)據(jù)庫的RDP classifier。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于16SrDNA測序的花鱸腸道菌群多樣性

對測序的原始數(shù)據(jù)去冗余處理及有效標(biāo)簽序列聚類后，鱸魚腸道內(nèi)容物及腸壁樣品分別得到OTU數(shù)為456個和293個，見表1。選取2分組中平均豐度>1的所有OTU（即高豐度并集OTU）繪制韋恩圖，見圖1。2組樣品共有OTU數(shù)目192個。

表1 花鱸腸道菌群樣品16 SrDNA測序數(shù)據(jù)

圖1 韋恩圖顯示花鱸腸道內(nèi)容物及腸壁樣品中OTU數(shù)目

對6個花鱸腸道內(nèi)容物及腸壁測序樣品的測序量和測序深度進(jìn)行評估，其Good’s coverage指數(shù)0.999±0.001，shannon稀釋曲線達(dá)到平臺期，說明測序量已基本覆蓋樣品中所有的物種。對花鱸腸道內(nèi)容物和腸壁菌群的α-多樣性分析結(jié)果見表2。從物種豐富度指數(shù)來看，花鱸腸道內(nèi)容物的物種豐富度高于腸壁。但從綜合體現(xiàn)物種的豐富度和均勻度的Simpson/Shannon指數(shù)來看，腸壁菌群略高于腸道內(nèi)容物。但α-多樣性指數(shù)的t檢驗顯示，兩者間的差異并不具統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）?；|腸道2個分組的菌群β-多樣性差異分析顯示，兩個分組間物種多樣性存在一定差異，但組間的差異并不具統(tǒng)計學(xué)意義（t檢驗，P>0.05），見圖2。

2.2 花鱸腸道菌群的物種分類及差異分析

對OTU進(jìn)行分類注釋的結(jié)果表明，中國花鱸腸道菌歸屬于22個門120個屬。其中厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門、擬桿菌門和放線菌門是最主要的類別，其他門類的細(xì)菌數(shù)量在總腸道菌中的數(shù)量占比均<1%，見表3。上述4個門類的細(xì)菌分別占腸道內(nèi)容物樣品和腸道壁細(xì)菌總量的98.98%和96.40%。厚壁菌門在腸道內(nèi)容物與腸壁樣品菌群中豐度最高，但腸道內(nèi)容物與腸壁樣品中變形菌門和梭桿菌門細(xì)菌的豐度則有較大的差異。其中梭桿菌門細(xì)菌在腸壁菌群中的占比（2.72%）遠(yuǎn)小于腸道內(nèi)容物（17.79%）。

表2 網(wǎng)箱養(yǎng)殖花鱸腸道菌群的α-多樣性指數(shù)

對花鱸腸道菌群屬的結(jié)構(gòu)組成變化分析表明，腸道內(nèi)容物中，發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）（15.5%）、鯨桿菌屬（Cetobacterium）（17.75%）和梭菌屬（Clostrid－ium）（12.45%）3個屬的細(xì)菌占比最高，而在腸壁菌群中，除上述3屬外，乳球菌屬（Lactococcus）、真桿菌 屬（Eubacterium）、Lachnoclostridium、Arcobacter、Flavonifractor也是主要的屬一級類群。

表3 中華花鱸腸道優(yōu)勢細(xì)菌門類及相對豐度 %

圖3 花鱸腸道菌群相對豐度>1%菌屬LEfSe分析

花鱸腸道內(nèi)容物和腸壁菌群物種差異的LEFse分析見圖3。在花鱸腸壁差異標(biāo)志性菌群中厚壁菌門的鏈球菌屬（Sreptococcaceae）、乳球菌屬（Lactococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus），變形菌門的不動桿菌屬（Acinetobacter）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）等為其主要類群。而在花鱸的腸道內(nèi)容物中則以梭桿菌門的鯨桿菌屬（Cetobacterium）、厚壁菌門的梭菌屬（Clostrdium）、消化鏈球菌屬（Peptostreptococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）和漫游球菌屬（Vagococcus）細(xì)菌為其主要的差異標(biāo)志性菌群。

3 討論

對有關(guān)花鱸腸道菌群的幾項研究[9-11]進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，盡管存在不同菌群的豐度差異，花鱸腸道菌群中還是以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門為主要優(yōu)勢菌。由于潘艷艷等[9]研究采用末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）技術(shù)，故其所得到的菌群的類型較少。文獻(xiàn)［11-12］的分析表明，在室內(nèi)養(yǎng)殖較小水體以花鱸幼魚為實驗對象且投喂人工配合餌料，得到變形菌門細(xì)菌在花鱸腸道菌群中的占比最高，其次為厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門。該研究結(jié)果與張琛等[10]的研究相似，花鱸均為沿海網(wǎng)箱養(yǎng)殖，投喂冰鮮魚糜，結(jié)果均得到花鱸腸道菌群中以厚壁菌門為最大的優(yōu)勢菌門類。文獻(xiàn)［18-20］研究表明，水體養(yǎng)殖環(huán)境與投喂餌料類型對魚類腸道菌群的形成和保持有重大的影響，因而推測養(yǎng)殖環(huán)境和餌料差異可能是造成不同研究間腸道菌群結(jié)構(gòu)差異的主要原因。

在生態(tài)學(xué)上，核心物種間的互利共生是保持生態(tài)系統(tǒng)多樣性和群落穩(wěn)定的重要因素[21-23]。已有不少研究證明了魚類腸道中存在核心微生物菌群[24-27]，腸道部分的生境過濾是形成魚類腸道微生物群落的主要驅(qū)動因素。將該研究與張琛等[10]的研究比較發(fā)現(xiàn)，花鱸腸道菌群屬級分類單元中梭菌屬（Clostridium）、發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）及乳球菌屬（Lactococcus）等屬是共有的優(yōu)勢菌屬，推測在網(wǎng)箱養(yǎng)殖花鱸腸道菌群中存在一個以上述菌屬為主要代表的具有宿主特征的核心微生物群落，但對魚類腸道核心菌群的功能及其相互作用還知之甚少，還有待深入研究。

在對魚類腸道菌群的研究中發(fā)現(xiàn)，腸壁黏液中細(xì)菌種群的豐度和多樣性與腸道內(nèi)容物中的微生物群落構(gòu)成不同，一些微生物種類在腸壁黏膜層的定植性較差[14，28-29]。胡俊[30]對斑馬魚腸道黏膜定植菌的研究發(fā)現(xiàn)，鯨桿菌屬細(xì)菌具有較好的魚類腸黏膜定植能力，是魚類微生物屏障功能的重要組成部分。但本研究中對花鱸腸道內(nèi)容物與腸壁菌群進(jìn)行差異分析，鯨桿菌屬則在腸道內(nèi)容物中占比較高，而在腸壁黏膜上定植量較少，其原因尚需進(jìn)一步考察。

在該研究中發(fā)現(xiàn)腸壁菌群中有多種細(xì)菌類別，如L.garvieae[31-32]、P.damselae[33-34]都是魚類的條件致病菌，驗證了許多病原體是魚類消化道菌群的組成部分的觀點(diǎn)[14，35]。在正常情況下，這些菌在腸道內(nèi)的定植對刺激宿主的免疫系統(tǒng)，提高對病原體的免疫力有重要作用[17]，但集約化養(yǎng)殖過程中因養(yǎng)殖環(huán)境惡化及飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)仍颍≡^度生長和廣泛傳播而導(dǎo)致病害的爆發(fā)[14]?？傊?，鑒于魚類消化道微生物區(qū)系的復(fù)雜性，還需要從魚類腸道菌群與宿主、環(huán)境互作等多個領(lǐng)域展開深入的研究。