趙倩倩, 王敏敏, 羅 成, 秦敬嘉, 李亞榮, 田 露

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

植物內(nèi)生菌對(duì)植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化起重要作用，能產(chǎn)生與宿主相同或相似的代謝產(chǎn)物[1,2].隨著對(duì)內(nèi)生菌的深入研究，現(xiàn)在已經(jīng)從植物內(nèi)生菌中分離出了大量新結(jié)構(gòu)、生物活性顯著的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要有生物堿類、萜類、甾體類、酚類、異香豆素類、苯丙素類、大環(huán)內(nèi)酯類、聚酮類、有機(jī)酸類等化合物，大多具有抗腫瘤活性、抗菌活性、抗氧化活性、抗病原菌、免疫抑制及對(duì)病蟲害的防治作用[3-7].

堿蓬屬(Suaeda) 植物廣泛分布于世界各地的鹽堿土地區(qū)，是一類典型的鹽生植物，屬于重要的鹽生植物資源[8-10].高鹽環(huán)境中生長(zhǎng)的耐鹽植物組織中可能蘊(yùn)藏著豐富的真菌，但從鹽堿地上生長(zhǎng)的耐鹽植物堿蓬根系分離真菌的研究甚少[7].

本研究從堿蓬中分離純化得到6株內(nèi)生真菌，以其中具有較高清除DPPH自由基的PTL-1菌株為目標(biāo)菌株,通過分子生物學(xué)手段對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，利用不同光譜技術(shù)及色譜分析方法對(duì)菌株代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離及鑒定.旨在了解我國(guó)鹽堿地耐鹽植物根際真菌及其代謝產(chǎn)物多樣性，為此類真菌資源的開發(fā)利用打下基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

從堿蓬分離得到6株內(nèi)生真菌，堿蓬采于陜西省榆林市鹽堿地.植物樣品取出后放入聚乙烯袋，4 ℃保存?zhèn)溆?菌株于-80 ℃冰箱保存.

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，切丁水煮30 min，過濾液加入葡萄糖20 g，1 000 mL水，瓊脂20 g.

1.1.3 試劑及儀器

PCR反應(yīng)體系購(gòu)于TAKARA公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；硅膠板：30X100 mm；葡聚糖凝膠：Sephadex LH-20.

PCR儀2720 thermal cycler(Applied Biosystems公司)；MQ D-0.4型壓力蒸汽滅菌器(邢臺(tái)醫(yī)療器械廠)；SW-CJ-IF單人雙面凈化工作臺(tái)(蘇州宏瑞凈化科技有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 N-1300(上海愛朗儀器有限公司)；ZF-2型三用紫外分析儀(上海市安亭電子儀器廠)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(西安莫吉娜儀器制造有限公司)；無菌96孔板(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；Bruker Avance 400m核磁共振波譜分析儀(德國(guó)Bruker公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離純化

內(nèi)生菌的分離純化如前所述[11].將新鮮堿蓬根、莖、葉清洗干凈，先后置于75%乙醇3 min和5%次氯酸鈉5 min進(jìn)行表面消毒處理，然后浸泡于硫代硫酸鈉溶液3 min進(jìn)行中和.用無菌水沖洗三遍，并用最后一次沖洗的無菌水作為漂洗對(duì)照.將表面消毒后的堿蓬組織取1 g置于研缽內(nèi)，加入5 mL無菌水后充分研磨.研磨后取上清液0.1 mL稀釋三個(gè)梯度在PDA平板上涂布.28 ℃培養(yǎng)1到3周.根據(jù)菌落形態(tài)及顏色挑取不同菌落，經(jīng)純化后甘油保藏于-80 ℃.

1.2.2 DPPH·自由基清除實(shí)驗(yàn)

采用DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)法測(cè)定每種菌株粗浸膏的抗氧化活性[12].樣品濃度分別為2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL，向各反應(yīng)體系加入200μmol/L的DPPH甲醇溶液3 mL，樣品(粗提物用甲醇溶解后分別配置成不同濃度樣品)2 mL，避光反應(yīng)30 min后于517 nm處測(cè)定吸光度，空白組用甲醇代替樣品，對(duì)照組用甲醇代替DPPH甲醇溶液，根據(jù)吸光度計(jì)算清除率，篩選出抗氧化活性強(qiáng)的菌株.

1.2.3 目標(biāo)菌株鑒定

目標(biāo)菌株鑒定參照文獻(xiàn)[13]方法.將分離得到的6株內(nèi)生菌進(jìn)行初篩，每株菌株用PDA培養(yǎng)基，220 r/min、250 mL培養(yǎng)液加入到500 mL錐形瓶中于恒溫28 ℃，轉(zhuǎn)速為220 r/min振蕩箱中發(fā)酵培養(yǎng)21天，21天后取出培養(yǎng)基，減壓抽濾，濾液用乙酸乙酯(體積比，乙酸乙酯∶濾液=1.5∶1)萃取得到粗浸膏，菌株鑒定用真菌基因組提取試劑盒提取各菌株的基因組DNA作為模板.采用真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1和2序列的通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行擴(kuò)增.產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將得到的菌株的測(cè)序序列在NCBI中進(jìn)行序列比對(duì)，獲得與其序列相似的其他菌株的序列.再用CLUSTALX1.83軟件進(jìn)行序列匹配排隊(duì)整理，用MEGA7.0軟件中的鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

1.2.4 發(fā)酵液粗提物的制備

發(fā)酵液粗提物的制備可參考文獻(xiàn)[14].菌株發(fā)酵21 d后取出發(fā)酵液，減壓抽濾得到濾液和菌絲體，按照濾液∶乙酸乙酯=1∶1.5的體積比用乙酸乙酯萃取，重復(fù)萃取3次，靜置待分層后合并有機(jī)層萃取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至蒸干(溫度：45 ℃，轉(zhuǎn)速：45 r/min)得到菌液浸膏A，用少量甲醇洗出至接收瓶，自然揮干，保存?zhèn)溆?將菌絲體搗碎置于500 mL的燒杯中，以甲醇浸提，置于超聲波下重復(fù)提取三次，每次2 h，減壓抽濾.濾液用1.5倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，重復(fù)三次，合并菌絲體提取液，減壓濃縮得到菌絲體乙酸乙酯萃取浸膏B，用少量甲醇洗出至接收瓶，自然揮干，標(biāo)記，備用.

1.2.5 粗提物的分離純化

粗提物的分離純化可參考文獻(xiàn)[15].

(1)硅膠柱層析(浸膏B)

將浸膏B進(jìn)行正相硅膠柱層析分析，用石油醚∶丙酮=1∶0、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1和1∶1作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫.用西林瓶接收洗脫液樣品，每瓶5 mL，經(jīng)TLC檢測(cè)，合并相同組分，得到9個(gè)組分，編號(hào)為F1-9.

(2)葡聚糖凝膠柱層析

實(shí)驗(yàn)用Sephadex-LH-20型葡聚糖凝膠進(jìn)行純化，取上述組分F5用甲醇至完全溶解后上樣，甲醇進(jìn)行洗脫.用西林瓶按順序連續(xù)收集洗脫液，得到各組分樣品，用薄層色譜檢測(cè)，合并相同組分，得到純化合物1及組分F5a-5h，備用.

(3)正向硅膠柱層析對(duì)F5d進(jìn)一步分離純化

根據(jù)組分F5d的量選擇合適的玻璃柱，干法裝柱，氯仿∶乙酸乙酯=50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1和1∶1進(jìn)行梯度洗脫.每個(gè)西林瓶收集5毫升洗脫液.TLC對(duì)收集液進(jìn)行檢測(cè)，得到純化合物2.

1.2.6 單體化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

單體化合物的結(jié)構(gòu)鑒定參考前述方法[16]，將分離得到的單體化合物1和2，分別用0.6 mL氘代氯仿溶解后，進(jìn)行核磁共振波譜檢測(cè)，通過lH NMR、13C NMR數(shù)據(jù)結(jié)果及文獻(xiàn)調(diào)研進(jìn)行結(jié)構(gòu)確定.

1.2.7 單體化合物的 DPPH·自由基清除實(shí)驗(yàn)

樣品濃度分別為300μg/mL、500μg/mL、700μg/mL、900μg/mL、1 000μg/mL，參照前述實(shí)驗(yàn)方法對(duì)分離得到的兩個(gè)甾體類化合物進(jìn)行DPPH·自由基清除作用檢測(cè).

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離及粗提物DPPH清除作用

對(duì)六種菌株用改良馬丁培養(yǎng)基(250 mL)在37 ℃恒溫振蕩箱220 r/min下培養(yǎng)21 d，而后對(duì)發(fā)酵液粗提物的浸膏進(jìn)行抗氧化測(cè)試，其結(jié)果如圖1所示.由圖1可以看出，菌株1對(duì)DPPH·自由基的清除率隨著濃度的增高而變高，但增長(zhǎng)趨勢(shì)比較平緩；菌株4對(duì)DPPH·自由基的清除率先增后降，濃度越高，其對(duì)DPPH·自由基的清除率反而減弱；菌株2，菌株3和菌株6對(duì)DPPH·自由基的清除率隨著濃度的升高而增大，但菌株2相對(duì)于菌株3和菌株6的增長(zhǎng)幅度要快，其對(duì)DPPH自由基的清除率也就越高，因此，本實(shí)驗(yàn)篩選出的目標(biāo)菌株為菌株2，隨后對(duì)該菌種進(jìn)行鑒定和擴(kuò)大培養(yǎng).

圖1 各菌株對(duì)DPPH自由基的清除率

2.2 菌種鑒定

菌種的菌落形態(tài)具輻射狀皺紋，邊緣菌絲體白色，質(zhì)地絨狀，分生孢子結(jié)構(gòu)大量，藍(lán)綠色，有些許淺黃色滲出液和可溶性色素，菌落反面呈淺黃褐色，如圖2(a)所示.將該菌株2命名為PTL-1，提取其基因組，通過通用引物PCR擴(kuò)增真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1和2的序列(圖2(a))，隨后送公司測(cè)序.通過分子生物學(xué)根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行菌種鑒定，結(jié)果顯示PTL-1為產(chǎn)黃青霉屬無性型真菌，屬于半知菌亞門絲孢綱絲孢目從梗孢科青霉屬的真菌，如圖2(b)所示.

(a)菌落形態(tài)及ITS基因PCR結(jié)果

(b)基于ITS序列鑒定菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹圖2 菌種鑒定結(jié)果

2.3 單體化合物的分離純化

對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)的8 L培養(yǎng)液經(jīng)過過濾得到菌絲體和菌液，菌液經(jīng)減壓濃縮得到1.006 g浸膏，菌絲體用甲醇浸泡，超聲波輔助提取3次，每次2 h，隨后經(jīng)減壓抽濾，乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得到10.056 g.

由于最后菌液所得浸膏量較少，所以將菌液浸膏編號(hào)，備用.而菌絲體浸膏量大，將菌絲體浸膏上硅膠柱層析進(jìn)行分離，具體的分離純化過程如圖3所示.以石油醚：丙酮為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，用西林瓶收集洗脫液，每瓶5 mL，依次編號(hào)，采用TLC進(jìn)行跟蹤鑒定，將相同組分進(jìn)行合并，最終得到9個(gè)洗脫組分，依次標(biāo)號(hào)F1～F9.

圖3 內(nèi)生菌次級(jí)代謝物分離純化流程圖

浸膏經(jīng)硅膠柱層析分離得到的洗脫組分F5用葡聚糖凝膠柱層析，以甲醇為洗脫劑進(jìn)一步分離純化，用西林瓶收集洗脫液，每瓶5 mL，依次編號(hào)，采用TLC對(duì)洗脫組分進(jìn)行分析，合并相同組分，得到純化合物1及組分F5a～F5h.

取洗脫組分F5d采用硅膠柱層析，以氯仿∶乙酸乙酯為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)TLC檢測(cè)，合并相同組分，得到純化合物2.

2.4 單體化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

內(nèi)生菌PTL-1發(fā)酵培養(yǎng)物菌絲體甲醇浸提部分分別經(jīng)過硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析等，得到化合物1和2(如圖4、圖5所示).經(jīng)核磁共振波譜分析以及與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比最終確定化合物1和2的結(jié)構(gòu)，分別是3β-羥基-(22E,24R) -麥角甾烷-5,7,22-三烯；5α，8α-氧橋麥角甾-3β-6,22-二烯[17].其具體結(jié)構(gòu)如圖6所示.

(a)化合物1的氫譜

(b)化合物1的碳譜圖4 化合物1的氫譜和碳譜

(a)化合物2的氫譜

(b)化合物2的碳譜圖5 化合物2的氫譜和碳譜

(a)化合物1

(b)化合物2圖6 單體化合物結(jié)構(gòu)

化合物1為針狀晶體.ESIMS(m/z 397[M+H]+)結(jié)合13C NMR給出分子式為C28H44O.仔細(xì)分析化合物的核磁數(shù)據(jù)(如表1～2所示)：

1H NMR(400 MHz,CDCl3)：δ0.622(s,3H,18-CH3),0.807-0.839(2d,J=6.8 Hz,6H,26-CH3,27-CH3),0.901(d,J= 6.8 Hz,3H,28-CH3),0.938(s,3H,19-CH3),1.037(d,J=6.6 Hz,3H,21-CH3),1.255-2.039(m,19H),2.278-2.310(tm,1H,H-4a),2.444-2.500(m,lH,H-4b),3.600-3.635(m,lH,H-3),5.168-5.208(m,H-22,H-23),5.358-5.388(m,1H,H-7),5.542-5.562(dd,IH,H-6).

13C NMR(400 MHz,CDCl3)：δ12.03 (C-18),16.26(C-19),17.59(C-28),19.63(C-26),19.95(C-27),21.08(C-21,C-11),22.97(C-15),28.29(C-16),31.96(C-2),33.06(C-25),38.34(C-10,C-1),39.04(C-12),40.43(C-20),40.76(C-4),42.79(C-24,C-13),46.19(C-9),54.52(C-14),55.66(C-17),70.42(C-3),116.24(C-7),119.54(C-6),131.91(C-23),135.53(C-22),139.76(C-5),141.35(C-8).

這些數(shù)據(jù)表明，化合物1的結(jié)構(gòu)被確定為(22E,24R)-ergosta-5,7,22-trien-3β-ol.

化合物2為白色粉末.ESIMS(m/z 429[M+H]+)結(jié)合13C NMR給出分子式為C28H44O3.仔細(xì)分析化合物的核磁數(shù)據(jù)(表1～2)：

1H NMR(400 MHz,CDCl3)：δ0.818 (s,3H,18-CH3),0.802-0.882(d,6H,26-CH3,27-CH3),0.911(d,3H,28-CH3),0.894(s,3H,19-CH3),1.002(d,3H,21-CH3),1.200-2.200(m,21H,steroid skeleton),5.140-5.208 (dd,2 X lH,H-22, H-23),6.233(d,J=8.5 Hz,1H,H-7),6.514(d,J=8.5 Hz,1H,H-6).

13C NMR (400 MHz,CDCl3)：δ12.83(C-18),18.15(C-19),17.53(C-28),19.93(C-26),19.61(C-27),20.84(C-21),23.35(C-11),20.58(C-15),28.64(C-16),30.04(C-2),33.01(C-25),36.85(C-10),34.62(C-1),39.26(C-12),39.73(C-20),36.89(C-4),44.50(C-13),42.71(C-24),50.98(C-9),51.61(C-14),56.10(C-17),66.39(C-3),130.68(C-7),135.15(C-6),132.22(C-23),135.36(C-22),82.12(C-5),79.38(C-8).

上述分析表明，該化合物2是一個(gè)甾體，鑒定化合物2為5α,8α-epidioxy-(22E,24R)-ergosta-6,22-dien-3β-ol.

表1 化合物1,2的13C NMR數(shù)據(jù)

表2 化合物1,2的1H NMR數(shù)據(jù)

2.5 單體化合物的 DPPH·自由基清除實(shí)驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)中，化合物1和2分別配置濃度為300μg/mL、500μg/mL、700μg/mL、900μg/mL、1 000μg/mL進(jìn)行DPPH·自由基的清除率檢測(cè).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,化合物在1 000μg/mL時(shí),化合物1和2對(duì)DPPH·自由基的清除率均小于15%.因此,化合物1和2對(duì)DPPH·自由基的清除作用較弱.

3 結(jié)論

本論文從堿蓬中分離純化得到6株內(nèi)生菌株，以抗氧化活性為目標(biāo)篩選菌株，發(fā)現(xiàn)菌株2對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)清除能力.根據(jù)分子生物學(xué)方法初步鑒定該菌株為產(chǎn)黃青霉屬無性型真菌，將其命名為PTL-1.并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、發(fā)酵液經(jīng)過濾、乙酸乙酯萃取和濃縮得菌絲體浸膏，浸膏分別采用硅膠柱層析和葡聚糖凝膠柱層析等分離手段對(duì)其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化.

進(jìn)一步利用核磁共振波譜對(duì)分離得到的單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，得到2個(gè)甾體化合物，對(duì)這兩個(gè)化合物進(jìn)行 DPPH·自由基清除實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明兩個(gè)甾體類化合物的DPPH·自由基清除作用較弱.該結(jié)論為篩選生物活性天然產(chǎn)物以及后期結(jié)構(gòu)改造奠定基礎(chǔ)，對(duì)充分利用我國(guó)微生物資源發(fā)現(xiàn)具有生物活性的天然產(chǎn)物具有重要的意義.