邊巴 德吉

（1.西藏林芝市朗縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局畜牧獸醫(yī)防疫站，西藏 林芝 860000；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009）

牛出血性敗血癥又簡稱牛出敗，是由多殺性巴氏桿菌感染引發(fā)牛出現(xiàn)以呼吸道癥狀和組織器官出血癥狀為主的急性、熱性傳染病，急性發(fā)病病程較短，常引起患牛死亡，群體中一旦有動物感染，則可威脅到同群其他動物［1］。多殺性巴氏桿菌可感染多種家畜，對于幼畜更易感染，幼畜感染后死亡率高于成年動物。近年來，關(guān)于牛出血性敗血癥的研究報道仍舊較多，結(jié)合現(xiàn)有資料表明，牛出敗已經(jīng)對我國牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成一定威脅［2］。

本病例中發(fā)病牦牛經(jīng)臨床和實驗室診斷，確診為多殺性巴氏桿菌感染，根據(jù)本試驗藥敏結(jié)果用藥以及對假定健康群體進行疫苗免疫后，疫情風(fēng)險一周內(nèi)得以消除。通過本研究的開展，能夠為西藏地區(qū)牦牛牛出敗的防治提供寶貴參考，同時能夠引起養(yǎng)殖戶對于牛出血性敗血癥的重視。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

西藏自治區(qū)某牧民家中死亡牦牛肺臟和肝臟。

1.2 儀器設(shè)備及試劑

5%綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基、MH（A）培養(yǎng)基購自青島海博生物有限公司；生化鑒定管、藥敏片購自杭州微生物試劑公司；分子生物學(xué)試劑購自迪寧生物；電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏儀器廠；引物合成和測序由上海生工完成。

1.3 細菌培養(yǎng)

于實驗室內(nèi)使用接種環(huán)將病料接種于血瓊脂平板，置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中36±1℃培養(yǎng)24 h，挑取菌落進行革蘭氏染色鏡檢，而后挑取單菌落再次接種于血瓊脂平板同樣條件進行培養(yǎng)。

1.4 生化鑒定

挑取純化培養(yǎng)物接種于生化鑒定管中，于電熱恒溫培養(yǎng)箱中36±1℃培養(yǎng)24 h～48 h觀察記錄結(jié)果。

1.5 16S rRNA基因PCR擴增及測序

挑取從死亡牛4 份肺臟和4 份肝臟病料中獲得的8 株分離菌菌落，添加于無菌蒸餾水中，100 ℃加熱10 min 后，12000 rpm 離心2 min 獲得DNA。PCR 擴增引物為27F:5′— AGAGTTTGATCCTGGCTCAG — 3′和

1492R：5′— TACGGC TACCTTGTTACGACTT — 3′，目的條帶大小為1300 bp。反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)程序為：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，共30 個循環(huán)；72℃10min。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并將PCR擴增產(chǎn)物送至上海生工測序。

1.6 動物致病性試驗

將27 只小鼠隨機分為9 組（n=3），實驗組8 組，對照組1組。實驗組分別以8株分離株的108cfu/mL 生理鹽水菌液0.2mL 腹腔注射小鼠，對照組使用無菌生理鹽水0.2mL腹腔注射小鼠，觀察記錄小鼠注射后變化。

1.7 藥物敏感性試驗

將新鮮菌液濃度調(diào)整至麥氏值0.5，均勻涂布于MH（A）瓊脂，使用紙片法進行藥敏試驗，參照紙片法藥敏判定標準判定結(jié)果。

2 試驗結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)

肺臟和肝臟病料接種培養(yǎng)24h 后，血瓊脂平板表面均可見針尖樣大小、露珠狀、邊緣整齊、透明的菌落。革蘭氏染色為陰性菌，菌體呈短球桿狀（圖1），菌落形態(tài)結(jié)合染色鏡檢結(jié)果，初步懷疑為多殺性巴氏桿菌。

圖1 革蘭氏染色鏡檢10mm×100mm

2.2 生化鑒定

生化鑒定試驗結(jié)果表明，8 株分離株蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露醇和觸酶試驗為陽性，乳糖、吲哚、M.R和V.P 試驗為陰性。生化鑒定結(jié)果與《伯杰氏細菌手冊》對比發(fā)現(xiàn)，分離株與多殺性巴氏桿菌生化反應(yīng)較為一致。

2.3 16S rRNA基因PCR和測序

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，分離株均擴增到約1300 bp 的目的條帶（圖2）。擴增產(chǎn)物測序結(jié)果登錄NCBI網(wǎng)站比對，結(jié)果表明8株分離株均與多殺性巴氏桿菌序列相似性達90%，確定所分離細菌為多殺性巴氏桿菌。

圖2 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

2.4 小鼠致病性試驗

實驗組小鼠均于48 h 內(nèi)死亡，死亡小鼠可見出血性肺炎、肝臟腫大、腸道充血。于死亡小鼠的肺臟和肝臟均再次分離到多殺性巴氏桿菌，證實所分離的多殺性巴氏桿菌菌株能夠引起小鼠病變，由此推測多殺性巴氏桿菌可能為本次引發(fā)牦牛感染死亡的病原菌。

2.5 藥物敏感性試驗

根據(jù)紙片擴散法藥敏實驗標準，測量抑菌環(huán)直徑后得到以下結(jié)果（表1）。

表1 藥物敏感性試驗結(jié)果

3 分析與討論

多殺性巴氏桿菌對多種動物均可造成威脅［3］，同群中有感染發(fā)病動物時，即可成為傳染源，家畜中以豬牛羊發(fā)病較多。通常認為，牛出血性敗血癥的主要傳染源是病牛［4］，病牛繼續(xù)通過分泌物和排泄物排出病原體，造成環(huán)境、水、飼料和用具受到污染，造成進一步傳播，也可通過呼吸道飛沫和吸血昆蟲傳播［5］。該病沒有明顯的季節(jié)性，但與熱、冷、熱、濕和雨季交替、擁擠、通風(fēng)不良、飼料突變、過度疲勞、長途運輸、寄生蟲感染等因素造成應(yīng)激或抵抗力下降時，病原體可能利用它引起疾?。?-7］。

本研究中，由現(xiàn)場調(diào)查、臨床癥狀觀察和實驗室診斷，最終確定該農(nóng)戶家中牦牛死亡是由于多殺性巴氏桿菌感染引起。在實驗室診斷過程中，及時建議養(yǎng)殖戶進行病牛隔離治療的同時加強消毒和緊急接種，最終疫情得到有效控制。通過本試驗的進行，能夠為牛出敗的防治和科學(xué)研究提供一定參考。