林樸卿 阮云軍

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院老年病科（廣州510515）

血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell，VEC）是映襯于血管壁的單層細(xì)胞，由于增齡或外界刺激誘導(dǎo)VEC 衰老是血管老化重要的始動(dòng)因素［1］，在動(dòng)脈粥樣硬化［2］、肺動(dòng)脈高壓［3］、腦卒中［4］等血管老化相關(guān)疾病發(fā)病過程扮演著關(guān)鍵角色。因此，研究VEC衰老機(jī)制，尋找衰老過程的關(guān)鍵靶點(diǎn)是防治血管老化相關(guān)性疾病有效手段［5］。由于增齡導(dǎo)致自然衰老細(xì)胞模型具有周期長(zhǎng)、代價(jià)大等缺陷，因而較少用于科學(xué)研究，取而代之的是誘導(dǎo)性細(xì)胞衰老。在饑餓、缺氧、氧化應(yīng)激等眾多誘導(dǎo)性衰老手段中，過氧化氫誘導(dǎo)氧化應(yīng)激是最為常用的細(xì)胞衰老誘導(dǎo)手段［6］，具有易于獲得、性質(zhì)穩(wěn)定、周期短等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也伴有不易控制、凋亡過多等缺點(diǎn)［7］。本研究將運(yùn)用H2O2制造人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（humen umbilical vein endothelial cell，HUVEC）衰老模型，并通過檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)HUVEC 功能、衰老和凋亡的指標(biāo)，探討H2O2誘導(dǎo)HUVEC 衰老的最適作用時(shí)間，為細(xì)胞衰老的科學(xué)研究提供可靠的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料HUVEC 細(xì)胞株由南方醫(yī)科大學(xué)中心試驗(yàn)室贈(zèng)送；DMEM 無酚紅培養(yǎng)基和澳洲胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gbico 公司；細(xì)胞用過氧化氫購(gòu)自上海麥克林公司；MTT 購(gòu)于美國(guó)Sigma?Al?drich 公司；細(xì)胞衰老SA?β半糖苷酶染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；細(xì)胞內(nèi)皮素（ET?1）、NO 檢測(cè)ELISA 試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物公司；MDA、SOD、GSH?px 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司；Bax、Bcl?2、p21、β?actin 兔抗人單克隆一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗均購(gòu)自美國(guó)CST 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理HUVEC 復(fù)蘇后置于37 ℃二氧化碳含量為5%孵育箱用含10%FBS 的DMEM培養(yǎng)，隔日換液，待細(xì)胞融合率達(dá)80%進(jìn)行傳代，取3 ～5 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；按H2O2刺激時(shí)間（0.5、1、3、6、12、24、48 和96 h）把HUVEC 分為9 組，分別是空白對(duì)照組、0.5 h 組、1 h 組、3 h 組、6 h 組、12 h組、24 h 組、48 h 組和96 h 組。

1.3 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增值活性HUVEC 消化離心后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為10×104個(gè)/mL，吸100 μL細(xì)胞懸液種于96 孔板，細(xì)胞分組及處理已如上述，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，處理后棄去舊培養(yǎng)基，予以100 μL 不含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基加10 μL MTT，避光37 ℃孵育4 h 后加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀570 nm 測(cè)OD值，棄去最大、最小值分析統(tǒng)計(jì)。

1.4 ELISA 檢測(cè)ET?1、NO 水平按照試劑盒說明書完成制備標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后上樣，洗板、加入工作液，再洗板最后到酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，具體操作步驟見試劑盒說明書。

1.5 MDA、SOD 和GSH?px 測(cè)定HUVEC 以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N于六孔板中，孵育過夜；然后按照上述分組進(jìn)行相應(yīng)處理；收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書要求完成MDA、SOD、GSH?px 的檢測(cè)。

1.6 Western blotHUVEC 細(xì)胞分組處理如上述，加入RIPA 冰上裂解0.5 h 提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。按照要檢測(cè)蛋白的分子大小在組裝好的電泳玻璃板中加入適量的10%過硫酸銨、四甲基二乙胺（TEMED）、30%丙烯酰胺（30%Acr?Bis）、蒸餾水等配制成適當(dāng)濃度的堆積膠與分離膠，插入梳子，每孔加入20 μL 總蛋，完成后續(xù)電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉后，分別以Bax、Bcl?2、p21 和β?actin 一抗4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次，每次10 min，37 ℃孵育二抗1 h，TBST 洗膜三次，ECL 顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。所得數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組之間的比較分析采用單因素方差分析法；組間多重比較采用最小顯著差異法（LSD）；兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；率之間的比較采用卡方分析；P＜0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

圖1 MTT 檢測(cè)細(xì)胞活力Fig.1 MTT assay detected cell viability

2.1 MTT 檢測(cè)細(xì)胞活力與空白組相比，H2O2刺激0.5 h到3 h內(nèi)，細(xì)胞活力逐漸增強(qiáng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；6 h 細(xì)胞增殖活性明顯下降（P＜0.05），往后隨著H2O2刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力逐漸下降，96 h 達(dá)到最低點(diǎn)。見圖1。

2.2 SA?β糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老在H2O2刺激0.5 h 到3 h 內(nèi)，HUVEC 未見明顯衰老著色；但隨著H2O2刺激時(shí)間的延長(zhǎng)（3 ～24 h），HUVEC 衰老染色陽性細(xì)胞明顯增加（P＜0.05），24 h 到達(dá)高峰，然后一直維持到96 h。見圖2。

2.3 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞因子變化與空白組相比，在短時(shí)間內(nèi)（0.5 ～3 h）H2O2刺激使HUVEC 分泌ET?1 和NO 增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)（3 h 以后），HUVEC 分泌ET?1 增多，24 h 到達(dá)最高值，然后一直減少；3 h后NO 逐漸減少（P＜0.05），96 h 達(dá)到最小值。見圖3。

圖2 SA?β糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老Fig2 SA?β staining detected cell senescence

圖3 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞因子變化Fig.3 Endothelial cells′function were detected by ELISA

圖4 各組細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的變化Fig.4 Oxidative stress in different groups

2.4 各組細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的變化與空白組相比，H2O2刺激各組細(xì)胞氧化應(yīng)激水平明顯升高，表現(xiàn)在MDA 增加，SOD、GSH?px 顯著降低（P＜0.05）。見圖4。

2.5 各組細(xì)胞凋亡和衰老蛋白表達(dá)變化研究結(jié)果提示，在H2O2刺激24 h 內(nèi)，各組細(xì)胞凋亡蛋白Bax 和Bcl?2 表達(dá)無差異；24 h 后，隨著H2O2刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，Bax 表達(dá)逐漸增多（P＜0.05），Bcl?2 表達(dá)逐漸減少（P＜0.05）。衰老蛋白p21 在H2O2刺激3 h 內(nèi)表達(dá)無差異，6 ～12 h 隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，p21 表達(dá)逐漸增多，24 h 最高（P＜0.05），48 h 后表達(dá)減少（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組細(xì)胞凋亡和衰老蛋白表達(dá)變化Fig.5 Expressions of apoptosis and senescence proteins in different groups

3 討論

正如被譽(yù)為“英國(guó)的希波克拉底”醫(yī)生THOMAS SYDENHAM 所說：“A man is as old as his arteries”，與個(gè)體衰老伴隨而來的是血管老化［8］。VEC 衰老是血管整體老化必不可少的改變，也是眾多血管老化相關(guān)疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、腦卒中、冠心病等疾病的重要始動(dòng)因素［9-11］。因此，有學(xué)者認(rèn)為，心腦血管疾病發(fā)病率隨著年齡逐漸增加的一個(gè)重要原因就是由于VEC 衰老降低了這些疾病的發(fā)病閾值［12］。

外源性H2O2是強(qiáng)氧化應(yīng)激因子，可通過損傷DNA、使端粒區(qū)域單鏈斷裂等機(jī)制在較短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞早衰［13］，使細(xì)胞高表達(dá)復(fù)制性衰老相關(guān)的標(biāo)志物，因此H2O2是優(yōu)秀的細(xì)胞衰老造模工具。但由于H2O2化學(xué)性質(zhì)活潑、不穩(wěn)定，因此關(guān)于H2O2造細(xì)胞衰老模型的濃度和時(shí)間不同實(shí)驗(yàn)室之間均存在較大的差異［14-15］。

本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期致力于VEC 衰老研究，經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證，項(xiàng)目成員發(fā)現(xiàn)200 μmol/L 的H2O2可制造出較為穩(wěn)定的HUVEC 衰老模型［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，在H2O2作用的0 ～3 h 內(nèi)，細(xì)胞活力反而增強(qiáng)，這是因?yàn)樵趶?qiáng)氧化應(yīng)激作用下，細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)通過調(diào)動(dòng)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)以“度過難關(guān)”［17］，因此此時(shí)間段內(nèi)細(xì)胞因子（NO、ET?1）分泌稍微增加，但衰老并不明顯。但隨著H2O2刺激時(shí)間的延長(zhǎng)（6 ～24 h），細(xì)胞氧化應(yīng)激水平持續(xù)升高并超過細(xì)胞應(yīng)激調(diào)整能力，細(xì)胞活力開始下降，NO 分泌減少，ET?1 分泌增加，p21 表達(dá)增加，SA?β陽性率升高，并且以24 h最明顯，即H2O2作用24 h 可作為衰老造模的可靠時(shí)間點(diǎn)。一旦超過24 h（48 ～96 h）細(xì)胞SA?β糖苷酶染色和p21 表達(dá)無明顯變化，持續(xù)升高的氧化應(yīng)激水平伴有凋亡蛋白表達(dá)明顯增高，細(xì)胞因子分泌減少，這就提示，過長(zhǎng)時(shí)間的氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增多，細(xì)胞衰老反而沒那么明顯。

強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激既可以引起細(xì)胞衰老，又可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［18］，因此H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的一大難點(diǎn)是如何確定一個(gè)合適的濃度和合適的作用時(shí)長(zhǎng)以保證衰老相關(guān)指標(biāo)表達(dá)明顯增高又能保證細(xì)胞凋亡不明顯［19］。由于細(xì)胞種系的不同，文獻(xiàn)報(bào)道的H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞衰老模型的濃度和處理時(shí)間亦不一致，濃度低者可至5 μmol/L［20］，高者可達(dá)1 000 μmol/L［21］；作用時(shí)間也從4 h［22］到5 d［21］不等。本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期致力血管老化的研究，結(jié)合前期研究基礎(chǔ)［22-24］并參考國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道［25-26］，認(rèn)為H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的濃度可因細(xì)胞種系和實(shí)驗(yàn)條件的不同而調(diào)整，但作用時(shí)間不宜過長(zhǎng)，一方面因?yàn)榇碳r(shí)間過長(zhǎng)可直接破壞線粒體質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞色素C 釋放至細(xì)胞質(zhì)，激活caspase 家族，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［27-28］；另一方面，刺激時(shí)間過長(zhǎng)可導(dǎo)致培養(yǎng)液血清耗盡，從而不能界定是氧化應(yīng)激還是營(yíng)養(yǎng)剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老［29-30］。綜合以上研究結(jié)果，筆者認(rèn)為200 μmol/L 的H2O2作用24 h 可成功誘導(dǎo)出HUVEC 衰老模型，可作為其他科學(xué)研究的參考。

本研究使用最為常用的H2O2作為工具藥物，通過連續(xù)觀察9 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)HUVEC 的功能、衰老和凋亡指標(biāo)，證實(shí)了200 μmol/L 的H2O2作用24 h可成功誘導(dǎo)出HUVEC 衰老模型，為血管衰老的研究提供了細(xì)胞模型，并可作為實(shí)驗(yàn)參考推廣至其他種系細(xì)胞的研究。但是，由于本研究監(jiān)測(cè)的時(shí)間點(diǎn)有限，觀察指標(biāo)尚不完整，因此仍需要進(jìn)一步的研究去完善H2O2造HUVEC 衰老模型的其他細(xì)節(jié)問題。