陳穎，楊博文，包博文，李智，車曉芳

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，沈陽 110001；2.遼寧省抗腫瘤藥物與生物治療重點實驗室，沈陽 110001）

全球結(jié)直腸癌發(fā)病率一直呈上升趨勢，每年新診斷的腸癌超過120萬例，死亡病例高達60余萬例［1］。但不幸的是，腸癌患者的存活率仍然很低，大約10%～15%的術(shù)后患者在5年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，近一半的腸癌患者生存時間不足5年［2］。奧沙利鉑是晚期腸癌一線化療方案不可或缺的藥物之一，但仍有將近50%患者對奧沙利鉑治療無反應(yīng)，且目前為止仍缺乏化療療效的預(yù)測因子［3］。

奧沙利鉑是鉑類家族化合物的一種，對腸癌細胞殺傷作用主要是與DNA堿基結(jié)合并與DNA相互作用，觸發(fā)凋亡途徑，造成DNA損傷［4］。截至目前，奧沙利鉑耐藥機制主要包括細胞內(nèi)藥物的低效攝取、抗氧化谷胱甘肽系統(tǒng)的解毒激活、DNA修復(fù)的增強和抗凋亡途徑的激活以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等［5-6］。但對奧沙利鉑藥物敏感性沒有特定的療效預(yù)測因子，找到奧沙利鉑療效相關(guān)的分子生物標(biāo)志物至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從基因表達數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）下載結(jié)直腸癌基因表達芯片數(shù)據(jù)集，篩選條件為晚期腸癌患者，含有奧沙利鉑藥物的療效評價信息，病例數(shù)＞30例，包含全基因組RNA表達譜數(shù)據(jù)。篩選出5個CEO數(shù)據(jù)集，分別為GSE27702、GSE69657、GSE72968、GSE72969和GSE72970。在 人類癌細胞系（national cancer institute，NCI60）數(shù)據(jù)庫中找到與奧沙利鉑相關(guān)的基因，按照相關(guān)性進行排序，P＜ 0.05納入統(tǒng)計。合并了CEO中5例的公開測序數(shù)并除去批間差，篩選出與奧沙利鉑相關(guān)的基因。將2種方法篩選出來的奧沙利鉑耐藥相關(guān)分子取交集，找出28個基因，其中包含雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶（dual specificity tyrosine phosphorylation regulated kinase 2，DYRK2），見圖1。

1.2 在線數(shù)據(jù)庫分析

應(yīng)用基因、蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系檢索工具（search tool for the retrival of interacting genes/proteins，String）找到與DYRK2相關(guān)蛋白，功能富集分析數(shù)據(jù)庫（the database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID）和功能富集分析數(shù) 據(jù)庫（Metascape）進行在線通路富集分析，基因表達譜分析數(shù)據(jù)庫（gene expression profilling interactive analysis，GEPIA）分 析DYRK2與Notch蛋白的相關(guān)性。

1.3 細胞系培養(yǎng)

HCT116和Caco2腸癌細胞購自上海中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，應(yīng)用含有10%滅活胎牛血清、1%青鏈霉素的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。細胞置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的常氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞長滿培養(yǎng)基90%左右，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳代頻率為3～4 d。所有實驗均采用對數(shù)生長期細胞。每8周棄掉細胞并復(fù)蘇凍存細胞。

1.4 MTT試驗

MTT法測定細胞活性，將細胞懸液（3×103/180 μL）加入到96孔培養(yǎng)板中，在37 ℃和5%CO2條件下進行培養(yǎng)。待細胞貼壁后，加入不同濃度的奧沙利 鉑（1 μmol/L、3 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L、50 μmol/L），在1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），在37 ℃和5%CO2條件下培養(yǎng)4 h。吸棄每孔中的溶液，并加入200 μL DMSO。采用酶標(biāo)儀檢測570 nm處的光密度（optical density，OD）值。按照公式計算細胞增殖百分比：相對細胞活性=（OD570測量-OD570空白）/（OD570對照-OD570空白）×100%。使用GraphPad Prism 7.0計算半抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）值。

1.5 脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染

HCT116和Caco2以8×104/孔接種在6孔板內(nèi)，待24 h細胞貼壁。將15 μL siRNA-DYRK2-NC、15 μL siRNA-DYRK2-1、15 μL siRNA-DYRK2-2分別加入于235 μL無血清無抗生素（雙無）的培養(yǎng)液靜置5 min，等待過程中將6 μL Lipofectamin2000輕輕加入于244 μL雙無的1640培養(yǎng)液中。后續(xù)將含有siRNA的培養(yǎng)液混入后含有Lipofectamin2000培養(yǎng)液靜置20 min。原培養(yǎng)板更換為1.5mL的雙無培養(yǎng)液。最后將總體積500 μL的混合液加入培養(yǎng)孔中，輕輕混勻。將細胞置入培養(yǎng)箱孵育6 h后，更換含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染72 h后收取PCR樣。

1.6 實時PCR

加入TRIzol溶解RNA。按照PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（日本TaKaRa公司）試劑盒說明書將800 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。后續(xù)按照SYBR?Premix EX TaqTM2（日本TaKaRa公司）試劑盒流程將800 ng cDNA配置成實時PCR反應(yīng)液。RT-qPCR用Applied Biosystems? 7500 Real-Time PCR Systems（美國Thermo公司）進行檢測，以18 S作為內(nèi)參，檢測DYRK2mRNA的表達。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性檢測

CELL細胞系NCI60中包括乳腺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腸癌、白血病、惡性黑色素瘤、肺癌、卵巢癌、前列腺癌以及腎癌腫瘤的細胞系，DYRK2與奧沙利鉑的藥物敏感性為負相關(guān)。在單獨腸癌細胞系中，DYRK2與奧沙利鉑的藥物敏感性也為負相關(guān)。即DYRK2的表達越高，奧沙利鉑越耐藥。見圖2。

2.2 DYRK2在腸癌細胞系Caco2和HCT116中的敲減效率

圖1 GEO數(shù)據(jù)集與NCI60篩選出的基因交集及mRNA表達Fig.1 Intersection of gene screening in GEO and NCI60 databases，and mRNA expression

圖2 DYRK2與奧沙利鉑敏感性Fig.2 DYRK2 and oxaliplatin sensitivity

將Caco2和HCT116細胞系分為對照組和不同DYRK2敲減序列組，48 h實時PCR驗證各組細胞中DYRK2的mRNA表達。結(jié)果顯示，與對照組相比，Caco2細胞系中si-DYRK2-1（0.299±0.037）和si-DYRK2-3（0.190±0.016）的mRNA表達減少（P＜ 0.000 1），HCT116細胞系中si-DYRK2-1（0.232±0.004）和si-DYRK2-3（0.223 ±0.019）的mRNA表達減少（P＜ 0.000 1）。見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染后Caco2和HCT116細胞中DYRK2的mRNA表達Fig.3 DYRK2 mRNA expression in Caco2 and HCT116 cells after siRNA knockdown

2.3 DYRK2敲減后Caco2和HCT116對奧沙利鉑的敏感性

Caco2和HCT116中DYRK2敲減48 h后，加入不同濃度奧沙利鉑進行MTT試驗，48 h后顯示敲減后細胞對奧沙利鉑敏感性增加。說明DYRK2在腸癌奧沙利鉑耐藥中發(fā)揮作用。見圖4。

圖4 敲減DYRK2后Caco2和HCT116細胞在不同奧沙利鉑濃度下的OD值Fig.4 After DYRK2 knockdown，OD values of Caco2 and HCT116 cells exposed to different oxaliplatin concentrations

2.4 String在線分析

將DYTK2輸入String數(shù)據(jù)庫中，設(shè)定中度相關(guān)，找到與DYRK2相關(guān)的11個蛋白，其中包括TP53等腫瘤相關(guān)蛋白，見圖5。

圖5 String在線分析Fig.5 String online analysis

2.5 DAVID和Metascape在線通路富集分析

將得到的28個基因，利用DAVID線數(shù)據(jù)庫進行GO分析，Metascape在線數(shù)據(jù)庫進行基因聚類分析，設(shè)定P＜ 0.05。結(jié)果顯示，GO分析中分子功能（molecular function，MF）包括鋅離子結(jié)合、氧化還原酶、天冬氨酸蛋白酶。細胞組分（cellular component，CC）包括高爾基體相關(guān)、細胞整體組分相關(guān)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)。生物過程（biological process，BP）包括細胞內(nèi)鐵離子、信號肽、膜蛋白、Notch信號通路。此外，基因聚類分析到二羧酸轉(zhuǎn)運子、膜蛋白胞外域蛋白水解等9個信號通路。GEPIA在線分析結(jié)果顯示，DYRK2與Notch的4個亞型Notch1相關(guān)性為0.33，Notch2相關(guān)性為0.63，Notch3相關(guān)性為0.43，Notch4相關(guān)性為0.30。提示DYRK2可能通過Notch其中的后續(xù)通路發(fā)揮奧沙利鉑的耐藥作用。見圖6。

圖6 在線數(shù)據(jù)庫進行后續(xù)通路分析及相關(guān)性分析Fig.6 Online databases queried for follow-up pathway and correlation analyses

3 討論

奧沙利鉑為腸癌患者帶來生存獲益，但奧沙利鉑耐藥也是導(dǎo)致化療失效或者療效減弱的重要原因之一。本研究篩選出5個GEO數(shù)據(jù)集，并且將NCI60中奧沙利鉑耐藥相關(guān)基因取交集，篩選出可能與奧沙利鉑相關(guān)的預(yù)測因子DYRK2。DYRK2是一個雙特異性酪氨酸（Y）磷酸化調(diào)節(jié)激酶基因，是進化保守的DYRKs家族的成員［7-9］。有研究［10］表明DYRK2參與許多生物學(xué)事件，如細胞周期進程和DNA損傷。癌細胞中DYRK2基因的敲除縮短了G1期，加速了細胞增殖［11］。此外，DYRK2與含有EDD、DDB1和VPRBP蛋白的E3連接酶復(fù)合體（EDVP復(fù)合體）結(jié)合。小干擾RNA介導(dǎo)的DYRK2缺失破壞了EDD-DDB1-VPRBP復(fù)合物的形成，這些觀察表明蛋白激酶DYRK2是促進E3連接酶組裝的支架［12］。DYRK2曾報道與腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)［13］，肝癌中與奧沙利鉑敏感性相關(guān)［14］，但在腸癌中與奧沙利鉑關(guān)系不清。

將選取的Caco2、HCT116腸癌細胞進行了DYRK2敲減，證實DYRK2表達減少后對奧沙利鉑的敏感性增加，說明DYRK2高表達與奧沙利鉑耐藥相關(guān)，對在線數(shù)據(jù)分析結(jié)果進行了驗證。首先應(yīng)用String數(shù)據(jù)庫分析了與DYRK2相關(guān)的11個蛋白，其中包括著名的TP53蛋白，研究［15］顯示，KRAS/TP53突變顯著增加了腸癌HCT116細胞對奧沙利鉑的活性，T53的半衰期縮短能夠抑制奧沙利鉑誘導(dǎo)的大腸癌細胞凋亡［16］。前期有研究［17］顯示DYRK2可以通過磷酸化Ser46調(diào)節(jié)TP53誘導(dǎo)DNA損傷誘導(dǎo)凋亡，DYRK2是否在奧沙利鉑耐藥中與TP53有協(xié)同作用后續(xù)有待基礎(chǔ)實驗驗證。通路富集中包括經(jīng)典Notch通路，Notch1受體胞內(nèi)區(qū)NICD1和非磷酸化的β-catenin是Notch1和Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的報告因子，在既往研究［18］建立的HCT116耐藥細胞系中表達上調(diào)。激活的Notch信號促進了腸癌干性相關(guān)基因的表達，從而導(dǎo)致了奧沙利鉑的耐藥［19］。GEPIA在線數(shù)據(jù)中看到DYRK2與Notch的4個亞型高度相關(guān)，后續(xù)可能通過Notch通路發(fā)揮作用。

綜上所述，DYRK2高表達提示奧沙利鉑耐藥，可能作為結(jié)直腸癌奧沙利鉑療效的預(yù)測因子，后續(xù)需要進一步在臨床患者中進行驗證，并且后續(xù)作用機制需要進一步深入研究，如能找到阻斷藥物，將使腸癌患者更大獲益。