李坤航，張旭東，趙丹，梁宇，鐘詩(shī)雨，趙偉東，包義君

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第四醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽(yáng) 110032；2.生命科學(xué)學(xué)院發(fā)育細(xì)胞生物學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122）

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是世界范圍內(nèi)最主要的致死和致殘?jiān)颍?］。在中國(guó)，每10萬(wàn)人中有13人因腦損傷而死亡［2］。TBI顯著增加其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病風(fēng)險(xiǎn)，包括慢性創(chuàng)傷性腦病、阿爾茨海默病和抑郁等［3］，從而帶來(lái)巨大社會(huì)壓力和經(jīng)濟(jì)損失［2］。腦血管損傷是TBI重要的病理生理過(guò)程，腦血管結(jié)構(gòu)破壞、功能障礙參與了TBI的發(fā)病、發(fā)展及損傷修復(fù)過(guò)程，并與繼發(fā)性損傷密切相關(guān)。血管功能障礙常表現(xiàn)為腦出血、腦梗死、腦水腫等［4］。腦血流是評(píng)估血管功能的重要指標(biāo)之一，大多數(shù)TBI患者在受傷后可以觀察到局部或整體的腦血流減少，進(jìn)一步導(dǎo)致缺血性腦損傷，這是TBI后死亡的主要原因［5］。但是，關(guān)于腦血流的恢復(fù)及其與運(yùn)動(dòng)功能的相關(guān)性研究很少。輕中度腦損傷后，腦血流通常會(huì)幾周內(nèi)恢復(fù)正常［4］，早期干預(yù)和合理調(diào)節(jié)腦血流可能會(huì)改善TBI患者的預(yù)后。

本研究旨在明確TBI后腦血流的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，探討腦血流變化與運(yùn)動(dòng)功能的相關(guān)性，為通過(guò)調(diào)節(jié)腦血流改善TBI患者的預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用84只12 h/12 h光/暗飼養(yǎng)的成年雄性C57BL/6野生型小鼠，體質(zhì)量25～30 g，12周齡（遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司）。所有實(shí)驗(yàn)在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理監(jiān)督下，符合動(dòng)物福利和倫理準(zhǔn)則。將小鼠隨機(jī)分為Sham組和TBI組，每組42只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)小鼠死亡，實(shí)驗(yàn)后給予小鼠安樂(lè)死。

1.2 方法

1.2.1 控制性皮質(zhì)撞擊（controlled cortical impact，CCI）損傷模型建立：采用CCI設(shè)備［6］（Pinpoint 精確皮層撞擊器PCI3000，美國(guó)Hatteras 公司）構(gòu)建TBI模型。CCI具有較強(qiáng)的可操作性和較高的準(zhǔn)確性，可控制撞擊參數(shù)（撞擊速度、撞擊深度和停留時(shí)間）以獲得不同程度腦損傷，并通過(guò)評(píng)估小鼠神經(jīng)功能和腦損傷深度判定TBI程度。TBI后小鼠神經(jīng)功能輕度下降而無(wú)腦組織結(jié)構(gòu)改變?yōu)檩p度；TBI后小鼠神經(jīng)功能明顯下降且腦損傷僅累及皮層未傷及海馬為中度；TBI后小鼠神經(jīng)功能明顯下降且腦損傷累及海馬或更深層腦組織為重度［7］。

小鼠用異氟烷麻醉后，將其頭部固定在立體定位架中，恒溫加熱墊維持體溫。術(shù)區(qū)消毒后，在頭皮上做一個(gè)長(zhǎng)約10 mm的正中切口，剝離皮膚和骨膜，在右頂骨上，以矢狀縫右側(cè)和冠狀縫后側(cè)3 mm處為中心，用顱鉆鉆開(kāi)直徑4 mm的圓形骨窗（圖1A）。TBI組小鼠在接受開(kāi)顱手術(shù)后，選擇直徑3 mm的圓形鋼制平頭撞擊器，撞擊器接觸硬腦膜后（圖1B），以1.5 m/s的撞擊速度、1.0 mm的撞擊深度垂直撞擊腦皮層，撞擊后停留50 ms?？p合皮膚，喚醒小鼠。Sham組小鼠只接受開(kāi)顱手術(shù)，不進(jìn)行撞擊。

1.2.2 激光散斑成像：使用激光散斑血流成像系統(tǒng)［8］（SIM BFI-HR，PRO迅微光電科技有限公司）測(cè)量腦血流量。分別于TBI前和TBI后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d、35 d對(duì)造模成功的小鼠進(jìn)行激光散斑成像。成像在恒溫麻醉下進(jìn)行，剪開(kāi)前期縫合皮膚，暴露顱骨并清洗。在圖像采集過(guò)程中，使用無(wú)菌棉保持曝光區(qū)域清潔干燥。在可見(jiàn)光下調(diào)整CCD攝像機(jī)焦距以獲得清晰圖像，之后轉(zhuǎn)換到785 nm激光狀態(tài)下采集腦血流信號(hào)，用LSCI軟件（SIM BFI軟件，光電科技有限公司）轉(zhuǎn)換成腦血流圖像。每隔1 s采集1張圖像，共采集20幅圖像。通過(guò)LSCI軟件對(duì)采集的腦血流圖像進(jìn)行分析，在小鼠腦左右對(duì)稱的固定位置，選取面積50 mm2圓形觀察區(qū)域，LSCI軟件自動(dòng)計(jì)算并生成觀察區(qū)域平均血流指數(shù)（blood flow index，BFI）。通過(guò)計(jì)算損傷側(cè)和損傷對(duì)側(cè)腦血流的相對(duì)變化分析TBI后腦血流的動(dòng)態(tài)改變，腦血流相對(duì)變化的計(jì)算公式：腦血流相對(duì)變化（%）=（損傷側(cè)BFI-對(duì)側(cè)BFI）/對(duì)側(cè)BFI×100。

1.2.3 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)：采用轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性（ZB-200，成都泰盟軟件有限公司）。首先在TBI前第3天開(kāi)始對(duì)小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練，訓(xùn)練3 d，每天訓(xùn)練3次，每次訓(xùn)練間隔為10 min，轉(zhuǎn)棒速度為20 r/min，使小鼠在300 s內(nèi)基本能夠隨轉(zhuǎn)棒做相應(yīng)運(yùn)動(dòng)，避免在轉(zhuǎn)棒上失去平衡而掉落。以TBI前第1天跌落時(shí)間為基線。然后分別于TBI后第1、3、5、7、10、14、21、28、35天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在20 r/min轉(zhuǎn)棒速度下記錄小鼠跌落時(shí)間，未跌落最長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)為300 s，每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，間隔10 min，將3次跌落時(shí)間均值記錄為每次跌落時(shí)間。

1.2.4 懸繩實(shí)驗(yàn)：將小鼠以懸臂狀態(tài)放在長(zhǎng)30 cm、直徑2 mm的懸繩上，然后被釋放。每只小鼠測(cè)試3次，根據(jù)缺陷嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分（0～3分）。小鼠立即從懸繩掉落，記為3分；2只前爪都掛在繩子上，試圖爬到繩子上，記為2分；2只前爪和1只或2只后爪都在繩子周圍，記為1分；4只爪子和尾巴在繩子周圍，有橫向移動(dòng)，記為0分。

1.2.5 壁架實(shí)驗(yàn)：將小鼠放在高35 cm、寬0.8 cm的籠子壁架上，監(jiān)測(cè)其運(yùn)動(dòng)情況。每只小鼠測(cè)試3次，根據(jù)缺陷嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分（0～3分）。小鼠從壁架上摔下來(lái)或拒絕行走，記為3分；小鼠沒(méi)有立即有效地在壁架上行走或從壁架上下來(lái)，記為2分；小鼠在壁架上行走時(shí)表現(xiàn)出腳部障礙，記為1分；小鼠沿著壁架行走，沒(méi)有腳部障礙（即松腳），然后小心翼翼地回到籠子里，記為0分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)值均以表示，2組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)分析和曲線擬合。

2 結(jié)果

2.1 小鼠中度TBI模型的構(gòu)建

TBI造模（圖1A、1B）后，腦組織出現(xiàn)出血和挫裂傷等表現(xiàn)（圖1C）。通過(guò)腦組織冠狀切片評(píng)估腦損傷區(qū)域，確認(rèn)腦損傷僅局限于皮層未傷及海馬（圖1D），達(dá)到中度TBI模型標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 構(gòu)建小鼠中度TBI模型Fig.1 Establishment of a mouse model of moderate traumatic brain injury（TBI）

2.2 TBI后腦血流的動(dòng)態(tài)變化

通過(guò)激光散斑技術(shù)量化TBI后局部腦血流變化，分別在小鼠腦左右對(duì)稱固定位置選取感興趣區(qū)域進(jìn)行數(shù)據(jù)采集（圖2A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TBI急性期損傷區(qū)域腦血流顯著減少，TBI后6 h、1 d、3 d腦血流分別減少了69.8%、62.9%、67.8%（圖2B、2C）。TBI后3 d腦血流開(kāi)始恢復(fù)，TBI后7 d腦血流雖然有所恢復(fù)，但仍減少了45.2%，直至TBI后14 d基本恢復(fù)到正常水平（圖2B、2C）。

圖2 TBI后腦血流的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes in cerebral blood flow（CBF）after traumatic brain injury（TBI）

2.3 TBI后小鼠運(yùn)動(dòng)行為學(xué)的變化

轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TBI導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙，TBI后小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間明顯下降至14.3 s，TBI后3 d下降至最低點(diǎn)13.5 s，之后運(yùn)動(dòng)能力逐漸恢復(fù)，TBI后5 d、7 d、10 d、14 d、21 d分別為79.6 s、141.4 s、193.8 s、263.0 s、286.0 s，直至TBI后28 d運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力恢復(fù)正常（圖3A）。懸繩實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TBI后1 d評(píng)分顯著增加，提示前肢肌力明顯受損，TBI后14 d受損肌力大部分恢復(fù)。壁架實(shí)驗(yàn)也得到相似結(jié)果，TBI后評(píng)分顯著增加，提示四肢協(xié)調(diào)能力下降，并于TBI后14 d基本恢復(fù)正常（圖3B）。

圖3 TBI后運(yùn)動(dòng)功能的變化Fig.3 Impaired motor function after traumatic brain injury（TBI）

2.4 TBI后腦血流動(dòng)態(tài)恢復(fù)與行為學(xué)變化的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，TBI后小鼠腦血流動(dòng)態(tài)恢復(fù)和行為能力恢復(fù)呈顯著正相關(guān)（r=0.984，P＜ 0.01）。TBI后當(dāng)腦血流減少時(shí)，小鼠行為能力下降；當(dāng)腦血流恢復(fù)時(shí)，小鼠行為能力也逐漸改善（圖4A）。以小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中跌落時(shí)間改變量百分比為因變量（Y），以腦血流改變量百分比為自變量（X），繪制散點(diǎn)圖（圖4B），根據(jù)圖形趨勢(shì)再進(jìn)行Pearson直線相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)2組變量呈線性相關(guān)（F=124，P=0.000 4）。Pearson直線回歸方程初步建立為Y=1.307X-5.744。

圖4 TBI后腦血流變化和行為能力變化的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of cerebral blood flow（CBF）and motor function after traumatic brain injury（TBI）

3 討論

TBI常導(dǎo)致腦血管出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷，繼而誘發(fā)血管痙攣、閉塞等改變，從而影響腦血流，腦血流變化后出現(xiàn)腦缺血、出血、外滲等現(xiàn)象，這些繼發(fā)性改變會(huì)再次影響腦血流。無(wú)論是原發(fā)性還是繼發(fā)性腦血流變化，都會(huì)導(dǎo)致腦損傷，引起神經(jīng)功能障礙［4，9］。TBI后，腦組織損傷大小、位置、類型以及損傷時(shí)間都會(huì)影響腦血流變化的形式和程度［9］。HAYWARD等［10］發(fā)現(xiàn)，患者遭受中度或重度TBI后，腦血流出現(xiàn)嚴(yán)重障礙，隨后緩慢恢復(fù)到生理水平。他們還通過(guò)灌注加權(quán)磁共振成像發(fā)現(xiàn)大鼠TBI后6 h同側(cè)皮質(zhì)腦血流減少，隨后24 h腦血流增加，TBI后2～14 d腦血流長(zhǎng)期下降。在小鼠TBI模型中也觀察到相似現(xiàn)象。ABRAHAMSON等［11］通過(guò)CCI模型發(fā)現(xiàn)，小鼠TBI后3周內(nèi)皮質(zhì)挫傷區(qū)腦血流一直保持低灌注狀態(tài)；而丘腦血流在TBI后3 d開(kāi)始恢復(fù)，在TBI后3周基本恢復(fù)至正常水平；海馬區(qū)血流在TBI后無(wú)明顯改變。然而，以往研究無(wú)論是在患者還是在動(dòng)物模型中，均是對(duì)幾個(gè)孤立時(shí)間點(diǎn)的腦血流檢測(cè)。而本研究首次持續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)小鼠TBI后腦血流變化，即TBI急性期局部腦血流顯著下降，減少了60%～70%，TBI后6 h下降程度最大，減少了69.8%。TBI后3 d腦血流逐漸恢復(fù)，TBI后7 d仍呈低灌注狀態(tài)，至14 d恢復(fù)至正常水平。本研究構(gòu)建了小鼠腦額葉運(yùn)動(dòng)區(qū)皮層中度TBI模型，完整記錄TBI后超急性期（TBI后6 h）、急性期（TBI后3 d）、亞急性期（TBI后3周）及恢復(fù)期腦血流從減少到恢復(fù)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化全過(guò)程。本研究的連續(xù)性血流分析更有利于指導(dǎo)后期腦血流調(diào)節(jié)治療，為后期臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

腦血流的平衡與穩(wěn)定是維持正常神經(jīng)功能的前提，腦血流改變會(huì)引起神經(jīng)功能障礙。LEISTNER等［12］在對(duì)中風(fēng)兒童的研究中發(fā)現(xiàn)，中風(fēng)患者重要組織中腦血流明顯低于同齡人。與非偏癱患者相比，偏癱患者腦血流灌注不平衡，特別是在運(yùn)動(dòng)區(qū)。INOUE等［13］發(fā)現(xiàn)，重度TBI患者中腦血流恢復(fù)好的患者，其神經(jīng)功能狀態(tài)預(yù)后要明顯好于腦血流無(wú)明顯恢復(fù)者。JING等［6］發(fā)現(xiàn)，TBI導(dǎo)致小鼠在急性期病變部位腦血流減少，然后逐漸恢復(fù)，至TBI后28 d恢復(fù)至正常水平，隨后神經(jīng)認(rèn)知功能改善。本研究發(fā)現(xiàn)，腦血流與運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)呈顯著正相關(guān)。TBI導(dǎo)致小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力顯著下降，尤其在TBI后3 d最差，與腦血流在TBI后3 d略有下降相對(duì)應(yīng)，隨著腦血流恢復(fù)而逐漸改善。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腦血流在TBI后14 d已恢復(fù)到正常水平時(shí)，運(yùn)動(dòng)功能仍存在缺陷，直到TBI后28 d恢復(fù)到正常水平，這說(shuō)明腦血流恢復(fù)早于運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，提示腦血流恢復(fù)是神經(jīng)功能恢復(fù)的前提與保障。本研究首次提出腦血流恢復(fù)是運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的必要條件，所以早期選擇適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)通過(guò)高壓氧或藥物等干預(yù)因素促進(jìn)腦血流恢復(fù)可能會(huì)改善TBI神經(jīng)功能恢復(fù)。

本研究建立的TBI模型模擬的是中等程度的TBI，在其他不同程度（如輕度和重度）的TBI模型中，腦血流和運(yùn)動(dòng)功能變化的相關(guān)性是否與本研究一致，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，TBI可導(dǎo)致腦血流下降和運(yùn)動(dòng)功能障礙，隨后腦血流和運(yùn)動(dòng)功能逐漸恢復(fù)，二者的恢復(fù)呈顯著正相關(guān)，且腦血流的恢復(fù)早于運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。本研究結(jié)果表明，臨床工作中可通過(guò)TBI患者腦血流恢復(fù)情況提早預(yù)測(cè)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況；同時(shí)，采取措施促進(jìn)腦血流恢復(fù)，可能會(huì)促進(jìn)患者運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。