高 芳，陳士剛，秦彩云，才巨鋒，王聰慧，董環(huán)宇，陶 晶*

(1.吉林省林業(yè)科學研究院林業(yè)生物技術研究所，吉林 長春 130033; 2.林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，黑龍江 哈爾濱 150040; 3.吉林省林木種苗管理站，吉林 長春 130022)

植物體細胞胚胎發(fā)生途徑具有繁殖速度快和再生率高等優(yōu)點[1-2]，不僅是優(yōu)良種質(zhì)材料大規(guī)模繁殖的有效方法，也是遺傳轉(zhuǎn)化研究中的最佳受體系統(tǒng)[3]，具有巨大的應用價值[4-6]。Morel等[7]曾提出體胚發(fā)生是針葉樹無性繁殖的首選方法。此外，利用胚性組織進行超低溫保存可以避免胚性愈傷組織在增殖過程中胚性逐漸喪失及變異等問題，并可以降低繼代成本，減小工作量[8]。通過體胚發(fā)生與超低溫技術相結(jié)合可以實現(xiàn)優(yōu)良種質(zhì)資源保存和規(guī)?；瘮U繁。云杉屬(Picea)樹種全世界約有40種，具有適應性強、抗逆性強、生長迅速等特性，是園林綠化的重要樹種。體細胞胚胎發(fā)生技術在云杉屬樹種中的應用，為其品種改良和規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化繁殖提供了可能。

紅皮云杉(Piceakoraiensis)是一種常綠喬木，分布于東北小興安嶺、吉林、朝鮮及烏蘇里地區(qū)[9-11]。紅皮云杉是我國東北林區(qū)主要的造林用材樹種，可作為建筑、航空、造紙和制造樂器的用材，造林前景廣闊。目前紅皮云杉主要采用播種和扦插繁殖，而通過體胚發(fā)生途徑的繁殖方法可以迅速獲得大量均一化、優(yōu)質(zhì)的苗木。紅皮云杉體胚發(fā)生技術起步較晚，報道較少，遠遠落后于其他云杉屬樹種，如麗江云杉(P.likiangensis)[12]、北美云杉(P.pungens)[13]等。有學者以紅皮云杉未成熟胚為外植體，獲得胚性愈傷組織[9,14-15]，并初步建立體胚發(fā)生技術體系[9-11,14]，但是體胚發(fā)育與成熟能力整體偏低，畸形胚比例偏高。迄今為止，紅皮云杉超低溫保存技術鮮見報道，限制了紅皮云杉優(yōu)良種質(zhì)資源的保存和規(guī)?；敝车倪M程。

植物體細胞胚胎發(fā)生調(diào)控是一個復雜的過程。大量研究表明，基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度、凝固劑濃度等對體胚發(fā)生起到至關重要的作用[16]。本研究以紅皮云杉合子胚為外植體，以改良RJW和1/2 LV為基本培養(yǎng)基，設置6種萘乙酸(NAA)和6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)激素濃度組合進行胚性愈傷組織誘導試驗，將獲得的胚性愈傷組織進行超低溫保存和體胚發(fā)育與成熟試驗；體胚成熟采用不同的脫落酸(ABA)和Gelrite濃度，確定適宜的體胚成熟培養(yǎng)條件。最后以改良RJW、1/2 RJW、LM、1/2 LM為基本培養(yǎng)基，確定體胚萌發(fā)的適宜培養(yǎng)條件，建立紅皮云杉體胚發(fā)生和超低溫保存技術體系，為紅皮云杉優(yōu)良種質(zhì)資源長期保存和規(guī)?；庇於ɑA。

1 材料與方法

1.1 材料采集與滅菌

于2018年8月，前往吉林省敦化市大蒲柴河林場(半同胞家系)采集紅皮云杉球果(合子胚為子葉胚期)。球果采回后，用體積分數(shù)75%的乙醇擦拭表面，剝出種子，用75%乙醇滅菌1 min，用無菌水沖洗3～5次；用質(zhì)量分數(shù)為10%次氯酸鈣溶液表面滅菌10 min，無菌水沖洗3～5次；剝出合子胚接種于胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上。

1.2 胚性愈傷組織誘導方法

以改良RJW和1/2 LV為基本培養(yǎng)基進行胚性愈傷組織誘導，培養(yǎng)條件如下：附加萘乙酸(NAA)3.0 mg/L、6-BA 1.0 mg/L、酸水解酪蛋白500 mg/L、L-谷氨酰胺1 000 mg/L、蔗糖20 g/L、3.5 g/L Gelrite、肌醇5 g/L，接種后置于23℃條件下暗培養(yǎng)。每處理8皿，每皿10個外植體，8周后統(tǒng)計胚性愈傷組織誘導率。

以改良RJW為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，即NAA分別是2、3、5 mg/L，6-BA 為0.5、1.0 mg/L，培養(yǎng)基內(nèi)均添加酸水解酪蛋白500 mg/L，L-谷氨酰胺1000 mg/L，蔗糖20 g/L，3.5 g/L Gelrite，肌醇5 g/L，每處理4皿，每皿10個外植體，接種后置于23 ℃條件下暗培養(yǎng)。8周后統(tǒng)計胚性愈傷組織誘導率。

1.3 胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)方法

以改良RJW為基本培養(yǎng)基進行紅皮云杉胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)添加NAA 2 mg/L、6-BA 0.5 mg/L、酸水解酪蛋白500 mg/L、L-谷氨酰胺1 000 mg/L(L-谷氨酰胺過濾滅菌加入)蔗糖20 g/L、3.5 g/L Gelrite、肌醇5 g/L，接種后置于23 ℃條件下暗培養(yǎng)。每2周繼代1次，3個月后進行體胚成熟和超低溫保存試驗。

在胚性愈傷組織增殖過程中進行細胞觀察。將長勢良好的胚性愈傷組織置于三角瓶內(nèi)，用質(zhì)量分數(shù)0.1%番紅染液染色10 min，然后將染色好的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到載玻片上，蓋上蓋玻片，用鉛筆輕輕敲打載玻片使胚性愈傷組織均勻散開，立即置于顯微鏡下觀察。

1.4 胚性愈傷組織超低溫保存方法

超低溫保存：選擇3個長勢良好的胚性細胞系HY-1、HY-2、HY-3，在胚性細胞系增殖培養(yǎng)7～10 d時取3 g置于含12 mL 0.4 mol/L山梨醇的培養(yǎng)基中，23 ℃黑暗條件下震蕩20 h。加入體積分數(shù)為99%的二甲基亞砜(DMSO)溶液1.125 mL+0.8 mol/L山梨醇培養(yǎng)基1.125 mL+0.4 mol/L山梨醇培養(yǎng)基0.75 mL，冰上靜置1.5 h后轉(zhuǎn)入1 mL離心管，置程序降溫盒內(nèi)迅速放入-80 ℃冰箱內(nèi)，2 h后迅速置于液氮中保存。

恢復培養(yǎng)：每個細胞系隨機選擇3個冷凍管迅速從液氮中取出，37 ℃水浴解凍2～3 min后轉(zhuǎn)入愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，將水浴解凍好的冷凍管中愈傷組織用移液槍取出，吸干表面水分后置于增殖培養(yǎng)基上恢復培養(yǎng)。為降低冷凍保護劑對愈傷組織的傷害，1 d后轉(zhuǎn)移至新的增殖培養(yǎng)基上，10 d后可以觀察到不同細胞系均有明顯的新生愈傷組織，15 d后大量增殖，表明超低溫保存后細胞可以恢復活力。

1.5 紅皮云杉體胚發(fā)育與成熟情況測定

1.5.1 ABA的影響

選擇3個細胞系(HY-1、HY-2、HY-3)進行體胚發(fā)育與成熟試驗，稱取100 mg長勢良好的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入50 mL的離心管中，加入去除植物生長調(diào)節(jié)劑的液體胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基3 mL，劇烈搖晃離心管使其充分散開，用移液槍將混合物轉(zhuǎn)移到濾紙上，再用布氏漏斗抽濾，將帶有胚性愈傷組織的濾紙放在固體培養(yǎng)基上，體胚成熟培養(yǎng)基為改良RJW+Gelrite 6 g/L+酸水解酪蛋白 750 mg/L+蔗糖 30 g/L+L-谷氨酰胺 450 mg/L。ABA濃度分別為10、20、30 mg/L，每個處理4皿，23 ℃ 暗培養(yǎng)45 d，記錄成熟胚的數(shù)量。

1.5.2 Gelrite濃度的影響

選擇3個細胞系(HY-1、HY-2、HY-3)，研究不同Gelrite濃度對體胚發(fā)育與成熟的影響，Gelrite分別為8、10、12 g/L，其他試驗條件與方法同1.5.1。每個細胞系5皿，23 ℃ 暗培養(yǎng)45 d，記錄成熟胚的數(shù)量。

1.6 紅皮云杉體胚萌發(fā)與植株再生

體胚萌發(fā)前需要進行干化處理，干化處理用6孔細胞板(Corning-Costar 3516)，其中3個孔放置兩層干燥無菌濾紙，然后把體細胞胚置于濾紙上，剩余3個孔裝入無菌水，最后用保鮮膜將細胞板密封，置于4 ℃條件下暗培養(yǎng)7～10 d，然后置于體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上。體胚萌發(fā)培養(yǎng)基選用改良1/2 RJW、改良RJW、1/2 LM、LM 4種基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基內(nèi)添加活性炭1.0 g/L +蔗糖20 g/L+Gelrite 3.5 g/L，暗培養(yǎng)7 d 后轉(zhuǎn)移至光條件下培養(yǎng)35 μmol/(m2·s)培養(yǎng)16 h，暗培養(yǎng)8 h 培養(yǎng)室溫度為23 ℃。2個月后轉(zhuǎn)移到相同的新鮮培養(yǎng)基上，2個月后進行移栽(移栽基質(zhì)中營養(yǎng)土、 蛭石、沙子體積比為3∶1∶1)。

1.7 培養(yǎng)條件與數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

除NH4NO3外所用試劑均購自Sigma公司，L-谷氨酰胺和ABA過濾滅菌加入冷卻至55 ℃左右的培養(yǎng)基中。所有培養(yǎng)基在滅菌前pH調(diào)至 5.8，高溫高壓蒸汽滅菌(121 ℃，20 min)。

采用Excel 2003統(tǒng)計數(shù)據(jù)并計算平均值。采用SPSS 22統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析，計算數(shù)據(jù)間的差異顯著性(P<0.05)；用CX31RTSF和SZ2-LGB型光學顯微鏡進行觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅皮云杉胚性愈傷組織誘導結(jié)果

2.1.1 基本培養(yǎng)基對紅皮云杉胚性愈傷組織誘導的影響

將紅皮云杉合子胚接種于胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上(圖1a)，2周后陸續(xù)有透明絲狀胚性愈傷組織從外植體上長出(圖1b、1c)；胚性愈傷誘導45 d后統(tǒng)計胚性愈傷組織誘導率，胚性愈傷誘導8周后檢查增殖培養(yǎng)結(jié)果(圖2)。統(tǒng)計結(jié)果可知，基本培養(yǎng)基對紅皮云杉胚性愈傷組織誘導率影響較大(外植體總數(shù)80)，1/2 LV培養(yǎng)基胚性愈傷組織誘導率較低[(22.50±5.90)%]，改良RJW培養(yǎng)基上誘導率為(30.00±5.34)%。兩種基本培養(yǎng)基相比較，改良RJW培養(yǎng)基更適合紅皮云杉胚性愈傷組織誘導。

a. 接種于胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上的合子胚zygotic embryos on embryogenic mass induction medium; b、c. 從外植體上長出的胚性愈傷組織embryogenic mass growed from explants。圖1 紅皮云杉胚性愈傷組織誘導Fig.1 Embryogenic mass induction of P. koraiensis

a.長勢良好的胚性愈傷組織embryogenic mass with good growth；b.胚性愈傷組織內(nèi)部的早期體胚early stage somatic embryo in embryogenic mass；c.超低溫保存恢復培養(yǎng)的胚性愈傷組織embryogenic mass of cryopreservation and recovery culture. 黑色箭頭指向恢復培養(yǎng)成活的胚性愈傷組織。 The black arrow points to the recovery of viable embryogenic mass.圖2 紅皮云杉胚性愈傷組織增殖和超低溫保存Fig.2 proliferation and cryopreservation of embryogenic mass of P. koraiensis

2.1.2 植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對胚性愈傷組織誘導的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對胚性愈傷組織誘導的影響顯著(表1)(P< 0.05)，當NAA質(zhì)量濃度為5.0 mg/L、6-BA質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時胚性愈傷組織誘導率最低為5.00%。當NAA質(zhì)量濃度為3.0 mg/L、6-BA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時胚性愈傷組織誘導率最高為50.00%，為紅皮云杉胚性愈傷組織誘導的最適植物生長調(diào)節(jié)劑濃度。

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對紅皮云杉胚性愈傷組織誘導的影響

2.1.3 紅皮云杉胚性愈傷組織增殖和超低溫保存

胚性愈傷組織誘導8周后進行胚性愈傷組織增殖試驗，胚性愈傷組織增殖過程中部分細胞系在繼代過程中逐漸褐化死亡，部分細胞系增殖良好(圖2a)并且內(nèi)部含有較多的早期體胚(圖2b)。胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)3個月后進行超低溫保存試驗，經(jīng)恢復培養(yǎng)10 d 左右可以清晰地看見成活的胚性愈傷組織(圖2c)，3個細胞系胚性愈傷組織均成活。

2.2 紅皮云杉體胚發(fā)育與成熟

紅皮云杉體胚發(fā)育與成熟培養(yǎng)10 d后晚期體細胞胚開始長出(圖3a)，20 d后進一步發(fā)育為球狀胚(圖3b)，35 d左右發(fā)育為成熟胚(圖3c)，成熟胚中部分為發(fā)育正常的體胚(圖3c黑色箭頭指向)，部分體胚發(fā)育畸形(圖3c紅色箭頭指向)。

a.晚期階段的體胚late stage somatic embryo； b.球狀胚globular embryo；c.成熟胚mature embryo。紅色箭頭指向畸形體胚。The red arrow points to the abnormal somatic embryo.圖3 紅皮云杉體胚發(fā)育與成熟Fig.3 Somatic embryo development and maturation of P. koraiensis

2.2.1 ABA對體胚發(fā)育與成熟的影響

ABA濃度對紅皮云杉體胚發(fā)育與成熟影響差異顯著(P< 0.01)，畸形胚比例差異也顯著(P< 0.05)(表2)。不同細胞系體胚發(fā)育與成熟能力差異較大(表3)，隨著ABA濃度的升高，體胚數(shù)量呈先升高后降低趨勢。當ABA質(zhì)量濃度為30 mg/L時，3個細胞系體胚發(fā)育與成熟能力均最低；當ABA質(zhì)量濃度為20 mg/L時，3個細胞系體胚發(fā)育與成熟能力最佳。但是，當添加Gelrite 6 g/L、ABA 20 mg/L時，3個細胞系畸形胚比例均偏高，特別是HY-1畸形胚比例高達77.14%。

表2 ABA濃度對紅皮云杉不同細胞系體胚發(fā)育與成熟的影響方差分析

2.2.2 Gelrite質(zhì)量濃度對體胚發(fā)育與成熟的影響

隨著Gelrite濃度升高，3個細胞系的體胚數(shù)量均呈逐漸降低趨勢(表3)。

表3 ABA和Gelrite濃度對紅皮云杉體胚發(fā)育與成熟的影響

當Gelrite為12 g/L時，3個細胞系體胚發(fā)育與成熟能力均最低，其中HY-1細胞系為12.00個/g，HY-3細胞系為0個/g。當Gelrite為8 g/L時，3個細胞系的體胚發(fā)育與成熟能力均最佳， HY-2細胞系為396.00個/g，畸形胚比例為10.33%。Gelrite濃度對體胚發(fā)育與成熟影響差異顯著(P< 0.01)(表4)。

表4 Gelrite濃度對紅皮云杉不同細胞系體胚發(fā)育與成熟的影響方差分析

2.3 體胚萌發(fā)與植株再生

紅皮云杉體胚成熟45 d后進行體胚萌發(fā)，不同基本培養(yǎng)基對紅皮云杉體胚萌發(fā)的影響差異顯著(P< 0.05)(表5)。在1/2 LM上體胚萌發(fā)能力最弱，其次是LM基本培養(yǎng)基，供試的4個基本培養(yǎng)基改良RJW體胚萌發(fā)能力最佳(圖4a)。不同細胞系體胚萌發(fā)能力也不同，整體來看，HY-3細胞系體胚萌發(fā)能力較低，然后是HY-1，最后是HY-2。體胚萌發(fā)4個月后進行移栽培養(yǎng)(圖4b、4c)。

表5 基本培養(yǎng)基對紅皮云杉體胚萌發(fā)的影響

a.體胚萌發(fā)germination of somatic embryos；b.再生植株regenerated plants；c.再生植株移栽transplanting of regenerated plants。圖4 紅皮云杉體胚萌發(fā)與植株再生Fig.4 Germination and regeneration of somatic embryos of Picea koraiensis

3 討 論

3.1 基本培養(yǎng)基

3.2 植物生長調(diào)節(jié)劑

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)被認為是體胚發(fā)生過程最重要的影響因素，對整個體胚發(fā)生過程的每一個環(huán)節(jié)起調(diào)控作用[21]，因此，深入了解外源性和內(nèi)源性激素對植物體胚發(fā)生的影響至關重要。針葉類植物愈傷組織的誘導一般在含有較高濃度的生長素和較低濃度的細胞分裂素的培養(yǎng)基上進行，且生長素被認為是胚性愈傷組織誘導階段最為關鍵的因子[22]。不同樹種反應不同，需要針對性篩選具體合適的濃度和組合[5,18]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源IAA保持較高水平是胚性細胞出現(xiàn)的標志，因此IAA水平在胚性愈傷組織誘導過程中起關鍵作用，而外源添加2,4-D可以改變外植體內(nèi)源IAA水平，從而促進體細胞胚向胚性細胞轉(zhuǎn)化[23]。本研究發(fā)現(xiàn)當NAA濃度為3.0 mg/L、6-BA濃度為0.5 mg/L時，胚性愈傷組織誘導率最高為50.00%，為紅皮云杉胚性愈傷組織誘導的適宜培養(yǎng)基。

3.3 超低溫保存技術

胚性愈傷組織超低溫保存是體細胞胚胎發(fā)生過程中基因型選擇和育苗的重要步驟[24]。由于優(yōu)良基因型的選擇是建立在離體和離體鑒定的基礎上的，因此從體胚發(fā)生技術體系的建立到苗木生產(chǎn)可能需要漫長的過程。但是胚性愈傷組織會在增殖培養(yǎng)一段時間后胚性減弱甚至喪失[25]，特別是針葉樹種[26]。超低溫保存是組織在超低溫(-196 ℃)下長期保存生存能力的技術，在加拿大、美國、法國、瑞典等國家，針葉樹無性系的體細胞胚胎發(fā)生和超低溫保存已被廣泛應用[27-28]。本試驗超低溫保存細胞系均成活，成功建立了紅皮云杉的超低溫保存技術，為規(guī)?；庇於嘶A。

3.4 ABA

胚性細胞轉(zhuǎn)變?yōu)轶w細胞胚是一個復雜的過程，受多種因素的影響，在離體培養(yǎng)條件下，應盡量保持與合子胚發(fā)育相似的環(huán)境，以提高成熟體細胞胚的數(shù)量和質(zhì)量[16]。針葉樹體胚發(fā)育與成熟階段一般需要撤除生長素、細胞分裂素且添加ABA的培養(yǎng)條件下進行。這種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的轉(zhuǎn)換是體胚成熟的一項重要措施，ABA不僅可以促進體胚成熟、防止畸形胚產(chǎn)生、抑制體胚的過早萌發(fā)[29]，還可以調(diào)節(jié)儲藏物質(zhì)的積累，增強脫水耐受性并調(diào)控體細胞胚的休眠[30]。有報道表明，花旗松(Pseudotsugamenziesii)的體胚成熟ABA濃度范圍為20～70 μmol/L時效果較好[31]。當挪威云杉體胚成熟過程中使用ABA處理1～9 d時，與對照相比含有ABA的培養(yǎng)基上成熟體細胞胚的產(chǎn)量增加了10倍[32]。Zhang等[33]報道了外源添加ABA在擬南芥(Arabidopsisthaliana)體胚發(fā)育不同階段的作用，進一步表明體胚發(fā)育對ABA的依賴性，同時ABA還改善了體細胞胚的形態(tài)學特征和數(shù)量。Zhang等[34]對落葉松的研究表明，在添加ABA的培養(yǎng)基上，體細胞胚的發(fā)育同步化較好且可以進一步發(fā)育為成熟的體胚，而在未添加ABA的培養(yǎng)基上，體細胞胚的發(fā)育不同步，且形態(tài)發(fā)育不充分。本研究結(jié)果顯示ABA的濃度對紅皮云杉體胚畸形率和體胚發(fā)生數(shù)量產(chǎn)生較大的影響，以添加20 mg/L ABA效果最佳。

3.5 Gelrite

培養(yǎng)基的滲透壓影響著植物的脫分化、再分化及器官的形成，針葉樹種也不例外[29]，在針葉樹合子胚發(fā)育過程中水分狀況變化對早期體細胞胚的發(fā)育進程至關重要。在不影響培養(yǎng)基水勢的情況下，常常通過增加培養(yǎng)基內(nèi)膠凝劑的強度來減少細胞的可用水量[35-37]。研究發(fā)現(xiàn)在體胚成熟培養(yǎng)基中添加0.8%～1.0% Gelrite和6%蔗糖獲得的體胚積累了更多的貯藏蛋白質(zhì)，當體胚發(fā)育伴隨著干化時必須在高濃度凝固劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，這種情況類似于合子胚的發(fā)育過程。本研究發(fā)現(xiàn)添加ABA 20 mg/L和Gelrite 6 g/L時，3個細胞系畸形胚比例均偏高，尤其是HY-1畸形胚比例高達77.14%。這可能因為Gelrite濃度偏低，培養(yǎng)物可用水量偏高，養(yǎng)分供應過大，從而導致體胚無法正常生長。而適當提高Gelrite濃度對3個細胞系的體胚數(shù)量增加雖無明顯影響，但是畸形胚的比例顯著下降，尤其是HY-2細胞系體胚數(shù)量為396.00個/g，畸形胚比例僅為10.33%。在前人研究的基礎上，本研究找到適宜的Gelrite濃度，提高體胚數(shù)量的同時，降低了畸形胚的發(fā)生率(最低為7.33%)，提高體胚轉(zhuǎn)化率(最高為60.00%)。另外，成功建立了紅皮云杉胚性愈傷組織超低溫保存技術，為紅皮云杉優(yōu)良種質(zhì)資源的保存和規(guī)模化繁育奠定基礎。

紅皮云杉胚性愈傷組織誘導的適宜培養(yǎng)基為改良RJW+NAA 3 mg/L+6-BA 0.5 mg/L；體胚發(fā)育與成熟適宜的培養(yǎng)基為改良RJW+ABA 20 mg/L+Gelrite 8 g/L；體胚萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基為改良RJW基本培養(yǎng)基。