吳麗君，游云飛，陳 達(dá)，陳文榮，李文芳

(1.福建省林業(yè)科學(xué)研究院，福建 福州 350012； 2.福建省洋口國有林場，福建 順昌 353211；3.國家林業(yè)和草原局南方山地用材林培育重點實驗室，福建 福州 350012；4.福建省森林培育與林產(chǎn)品加工利用重點實驗室，福建 福州 350012)

金花茶組植物(CamelliaSect.nitidissimaChi)是山茶科山茶屬植物中唯一開金黃色花的珍稀觀賞植物[1-4]，素有“植物界的大熊貓”“茶族皇后”之美稱[1]，具有較高的觀賞價值和育種價值；金花茶花、葉富含茶多酚、黃酮等對人體有益的天然營養(yǎng)物質(zhì)，藥用價值高[5]。

隨著金花茶觀賞、藥用價值的不斷開發(fā)和利用，金花茶人工種植面積逐年增長，種苗供不應(yīng)求。組培快繁是植物良種快繁的主要技術(shù)途徑，組培苗生根率和移栽成活率是組培產(chǎn)業(yè)化的重要技術(shù)指標(biāo)。山茶科植物，組培生根及移栽成活率低[6]一直是金花茶組培產(chǎn)業(yè)化的瓶頸[7]。黃曉娜等[7]研究了金花茶試管苗瓶外生根技術(shù)，但生根成活率遠(yuǎn)低于生根率；李桂娥等[8]通過生長調(diào)節(jié)劑處理芽苗促進(jìn)了金花茶組培苗不定根的發(fā)生，但操作復(fù)雜，難以普及推廣。筆者以‘黃樽’薄葉金花茶(C.chrysanthoides‘Huangzun’)[10-12]為材料，在優(yōu)選培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，優(yōu)化和提升生根培養(yǎng)和移栽技術(shù)，為金花茶組培產(chǎn)業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料選取與處理

以‘黃樽’薄葉金花茶繼代苗為原材料?！S樽’薄葉金花茶是福建省林業(yè)科學(xué)研究院于2017年通過審定的金花茶良種[9-11]，省林木良種編號：閩R-SV-CC-027-2017。

選用培養(yǎng)60 d以上的繼代苗，切取帶頂芽、苗高2.0 cm以上的單芽為生根試驗材料。每個單芽含3枚以上舒展葉片，葉長0.5 cm以上，葉片轉(zhuǎn)綠或淺綠，苗徑0.5 mm以上。金花茶組培苗葉片較大，為方便操作，接種時將苗基部1.0 cm以下的葉片切除。

1.2 基本培養(yǎng)基與植物生長調(diào)節(jié)劑組合的篩選

采用L9(33)設(shè)置基本培養(yǎng)基(1/2 B5、3/4 B5、B5)、ABT(0、0.5、1.0 mg/L)、吲哚丁酸(IBA)(0、0.5、1.0 mg/L)處理正交組合形成9種生根培養(yǎng)基[12]。每種培養(yǎng)基接芽苗30株，重復(fù)3次，轉(zhuǎn)接60 d，統(tǒng)計生根率。培養(yǎng)基均附加15 g/L白糖、瓊脂6.0 g/L，調(diào)制其pH為5.8[8]。

1.3 培養(yǎng)基質(zhì)與附加物組合的篩選

以1/2 B5+ABT 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L為基本培養(yǎng)基，2種培養(yǎng)基質(zhì)[V細(xì)河沙∶V蛭石=1∶1(河沙蛭石基質(zhì))、瓊脂]與2種附加物(白糖、活性炭)形成5種組合，即：①瓊脂6.0 g/L+白糖0 g/L；②瓊脂6.0 g/L+白糖15 g/L；③瓊脂6.0 g/L+白糖15 g/L+活性炭3.0 g/L；④河沙蛭石基質(zhì)+白糖0 g/L；⑤河沙蛭石基質(zhì)+白糖15 g/L，調(diào)制pH為5.8[8]。每個組合接芽苗30株，重復(fù)3次，芽苗轉(zhuǎn)接60 d，統(tǒng)計生根率，觀察芽苗根系生長情況。

組合④的制備：將粒徑1.0～2.0 mm細(xì)河沙經(jīng)清水淘洗濾干，與粒徑2.0～3.0 mm蛭石按體積比1∶1均勻混合制成河沙蛭石基質(zhì)，用上述基本培養(yǎng)基溶液浸泡混合基質(zhì)約30min后，濾去多余水分，裝入培養(yǎng)瓶，經(jīng)高溫高壓(溫度121 ℃、壓力1.1 kg/cm2)滅菌30 min[12]。組合⑤的制備參照④。

芽苗接種在河沙蛭石基質(zhì)上，應(yīng)先用接種針在基質(zhì)上打出小孔，再將芽苗插入基質(zhì)孔中，插入深度以苗高的1/3～1/2為宜；接種后，輕輕敦實基質(zhì)，確保芽苗基部與基質(zhì)接觸良好。

1.4 補充白糖、K2HPO4

以組合④，即河沙蛭石基質(zhì)+1/2 B5+ABT 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L為生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)35 d(此時部分芽苗基部發(fā)根)，分別補充經(jīng)滅菌的⑥白糖15.0 g/L、⑦K2HPO415.0 mg/L、⑧白糖15.0 g/L+K2HPO415.0 mg/L、⑨CK(對照組，不補充白糖和K2HPO4)形成4種處理。每個處理芽苗30株，重復(fù)3次。

生根培養(yǎng)60 d后，4種處理的生根苗經(jīng)7～10 d煉苗后，移栽到移栽專用基質(zhì)(V細(xì)河沙∶V蛭石=3∶1)上；栽后采用塑料薄膜和遮光率75%的遮陰網(wǎng)覆蓋，保持拱棚內(nèi)空氣濕度85%、溫度(24±4) ℃，直至小苗長出新葉，再逐漸打開遮陰網(wǎng)和薄膜[7，12]。

移栽前調(diào)查生根率、黃化率、平均莖粗；移栽60 d后，統(tǒng)計移栽成活率[11]。

1.5 生根培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度為(24±2) ℃；生根培養(yǎng)前15 d，光照度150～300 lx；培養(yǎng)15～35 d，光照度1 200～1 500 lx；培養(yǎng)35～60 d，光照度1 800～2 300 lx；移栽前煉苗，可充分利用自然散射光，避免陽光直接照射[12]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件分析，Tukey法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基與植物生長調(diào)節(jié)劑組合對生根率的影響

9種(組合)培養(yǎng)基的生根率見表1，其方差分析結(jié)果為F培養(yǎng)基=70.3>F0.01(8，16)=3.89，P培養(yǎng)基=0.000 1；表明培養(yǎng)基對生根率的影響達(dá)極顯著水平。依據(jù)生根率極差值(RABT>R基本培養(yǎng)基>RIBA)推斷，對生根率影響大小依次為ABT、基本培養(yǎng)基、IBA。多重比較表明培養(yǎng)基2號和3號的生根率分別為42.2%和41.1%，與其他培養(yǎng)基生根率達(dá)極顯著差異。因此，較優(yōu)的培養(yǎng)基為1/2 B5+ABT 0.5～1.0 mg/L+IBA 0.5～1.0 mg/L。培養(yǎng)基7號、8號和9號的芽苗生根率低且葉片厚質(zhì)化，這可能與基本培養(yǎng)基B5含較高濃度鹽有關(guān)[13]。

表1 基本培養(yǎng)基與植物生長調(diào)節(jié)劑組合對生根率的影響

2.2 培養(yǎng)基質(zhì)與附加物組合對生根率的影響

不同培養(yǎng)基質(zhì)與附加物組合對生根率的影響情況見表2。5個組合中，平均生根率最高是組合④，其次為⑤，分別為84.4%和68.9%；平均生根率最低是組合③，為33.3%。河沙蛭石基質(zhì)平均生根率均高于瓊脂，且芽苗粗壯，葉片舒展，根系發(fā)達(dá)，須根多?？梢姡哂辛己猛笟庑院统炙缘暮由瞅问|(zhì)較透氣性差的瓊脂更有利于根的誘導(dǎo)與生長[13]。無附加物的組合①和④的平均生根率均高于對應(yīng)附加白糖或白糖+活性炭的組合②、③和⑤。肖玉蘭[13]認(rèn)為無糖培養(yǎng)基可以促進(jìn)植株盡早生根，提高生根率；譚文澄等[14]認(rèn)為白糖培養(yǎng)基較高的滲透勢和活性炭的吸附性不利于芽苗生根。

表2 不同培養(yǎng)基質(zhì)與添加物組合對生根率的影響

圖1 瓊脂上(A)和河沙蛭石基質(zhì)上(B)的生根芽苗Fig.1 Rooting shoots on agar and substrate with sand and vermiculite

平均生根率方差分析結(jié)果為F組合=104.38>F0.01(4，8)=7.01，P組合=0.000 1；表明培養(yǎng)基質(zhì)與附加物組合對生根率的影響達(dá)極顯著水平。多重比較表明組合④即無附加物的河沙蛭石基質(zhì)平均生根率最高，為84.4%，極顯著高于其他組合，因此最優(yōu)組合為④。

生根培養(yǎng)后期，組合④有部分芽苗葉片黃化易脫落，而組合⑤芽苗葉色正常，顯然無糖的河沙蛭石基質(zhì)有利于芽苗生根，但不利于芽苗后期生長。

2.3 補充白糖、K2HPO4對生根率、移栽成活率和黃化率的影響

補充白糖或K2HPO4等4種處理對芽苗生根率、移栽成活率和黃化率的影響見表3，芽苗生根率方差分析結(jié)果為F處理=2.695

表3 補充白糖與K2HPO4對芽苗生根率、移栽成活率和黃化率的影響

處理⑧和⑥未見芽苗黃化，對照組⑨和處理⑦芽苗均有黃化現(xiàn)象。植物異養(yǎng)條件下，糖是植物細(xì)胞代謝的主要能源，是植物離體培養(yǎng)必不可少的物質(zhì)[13]，因此生根培養(yǎng)后期補充白糖15.0 g/L利于芽苗后續(xù)生長。處理⑧的芽苗葉片濃綠、粗壯，平均莖粗2.16 mm，最大莖粗2.80 mm(圖2)；處理⑥的芽苗葉色淡綠；因此綜合芽苗生根率、黃化率及長勢，最佳處理是⑧。

另外，試驗觀察到無糖的河沙蛭石基質(zhì)(V細(xì)河沙∶V蛭石=1∶1)上，芽苗污染率較瓊脂培養(yǎng)基的芽苗污染率低，約0.5%。傳統(tǒng)培養(yǎng)基中的糖和瓊脂(或卡拉膠)是造成污染的主要原因[13]，芽苗污染率通常為2%～5%[15]。

表3中，處理⑧和⑥的移栽成活率較高，分別為93.9%和90.1%；方差分析結(jié)果：F處理=211.5>F0.01(3，6)=9.78，P處理=0.000 1，表明4種處理的移栽成活率差異極顯著。多重比較結(jié)果表明：處理⑧和⑥的移栽成活率與對照組⑨和處理⑦差異極顯著；說明生根培養(yǎng)后期補充白糖可顯著提高芽苗移栽率成活率。綜合考量生根率、移栽成活率、芽苗黃化率和長勢等指標(biāo)，最佳處理是⑧，即生根培養(yǎng)后期補充白糖15.0 g/L+K2HPO415.0 mg/L。

圖2 補充白糖+K2HPO4的生根芽苗及移栽情況Fig.2 Rooting shoots and transplantation situation on substrate added sugar and K2HPO4

3 討 論

‘黃樽’薄葉金花茶在傳統(tǒng)的白糖瓊脂培養(yǎng)基上，未獲得理想的生根效果，在優(yōu)選的培養(yǎng)基1/2 B5+ABT 0.5～1.0 mg/L+ IBA 0.5～1.0 mg/L+白糖15 g/L+瓊脂6.0 g/L上，培養(yǎng)60 d，生根率僅為42.2%～41.1%。

不同培養(yǎng)基質(zhì)(河沙蛭石基質(zhì)、瓊脂)與附加物(白糖、活性炭)組合對‘黃樽’薄葉金花茶生根率影響極顯著，以河沙蛭石基質(zhì)替代培養(yǎng)基1/2 B5+ABT 0.5～1.0 mg/L+IBA 0.5～1.0 mg/L中的瓊脂和白糖，平均生根率達(dá)84.4%，且芽苗粗壯、葉片舒展、根系發(fā)達(dá)。李桂娥等[8]通過液體濾紙橋培養(yǎng)法改善了根的誘導(dǎo)環(huán)境，提高了金花茶生根率，但該培養(yǎng)法不便于普及推廣。因此對于組培生根困難植物，選擇透氣性基質(zhì)結(jié)合無糖或低濃度糖培養(yǎng)，以改善根的誘導(dǎo)環(huán)境是提高生根率的有效方法[13]。此外，采用無糖的河沙蛭石基質(zhì)生根培養(yǎng)，也可大幅度降低芽苗污染率。

在生根培養(yǎng)基(河沙蛭石基質(zhì))+1/2 B5+ABT 0.5 mg/L+ IBA 0.5 mg/L上培養(yǎng)35 d后，分別補充白糖15.0 g/L、K2HPO415.0 mg/L、白糖15.0 g/L+K2HPO415.0 mg/L及CK等4種處理對平均生根率的影響不顯著，但對移栽成活率影響極顯著；補充白糖15 g/L+ K2HPO415.0 mg/L，有效克服芽苗黃化，提高芽苗質(zhì)量，進(jìn)一步提高了芽苗生根率和移栽成活率，芽苗生根率和移栽成活率分別為91.1%和93.3%。參考對組培苗的培養(yǎng)優(yōu)化措施[16]，K元素能夠促進(jìn)植物生長健壯，保障各種代謝活動的順利進(jìn)行[17]，K2HPO4或KH2PO4富含K離子，因此被廣泛用于調(diào)控植物的生長發(fā)育。單妍[16]用KH2PO4處理香糯竹黃化組培苗，獲得了較好效果。適宜濃度KH2PO4噴施桃葉和月季葉片可增加葉綠素含量和葉片干質(zhì)量[18-19]，對月季新梢的莖長和莖粗有明顯的促進(jìn)作用[19]。徐莉莉等[20]研究認(rèn)為噴施KH2PO4能顯著提高紅葉桃的凈光合速率?！S樽’薄葉金花茶生根培養(yǎng)時間長達(dá)60 d以上，較長時間的無糖培養(yǎng)勢必因碳源缺失導(dǎo)致芽苗葉片黃化；因此，及時補充糖等碳源物和K2HPO4，對提高芽苗質(zhì)量，進(jìn)而提高芽苗生根率和移栽成活率是極為有利。

綜上所述，‘黃樽’薄葉金花茶通過傳統(tǒng)的白糖瓊脂培養(yǎng)法，生根率低、芽苗長勢差，且芽苗移栽成活率低；而用河沙蛭石基質(zhì)(V河沙∶V蛭石=1∶1)+1/2 B5+0.5～1.0 mg/L+IBA 0.5～1.0 mg/L的無糖培養(yǎng)法，培養(yǎng)后期補充白糖15 g/L+K2HPO415.0 mg/L，是提高‘黃樽’薄葉金花茶生根率和移栽成活率的有效方法，也是其他組培生根困難的植物尤其是金花茶組植物離體培養(yǎng)可借鑒的培養(yǎng)方法。