金顯春，宋嘉寧

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林與藝術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，水稻是我國(guó)主要農(nóng)作物之一，每年產(chǎn)生稻草多達(dá)2億多噸，占秸稈總產(chǎn)量的27.96%[1]。隨著農(nóng)民生活水平的提高以及城鎮(zhèn)化的加速，農(nóng)民的燃料由原來(lái)的生物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橐夯瘹?、煤等化石能源。化石能源的使用，釋放出大量溫室氣體以及氮氧化物和硫氧化物，導(dǎo)致全球變暖以及大氣污染。而稻草作為燃料以及飼料的功能逐漸下降甚至消失，導(dǎo)致大量的稻草成為廢棄物，主要處理措施為就地掩埋或是露天焚燒，造成資源浪費(fèi)以及環(huán)境污染[2-3]。利用稻草發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇可顯著降低因稻草就地掩埋以及露天焚燒造成的環(huán)境污染，同時(shí)有效避免利用糧食生產(chǎn)乙醇的第一代生物乙醇的與糧爭(zhēng)地，與人畜爭(zhēng)糧的缺陷，成為世界各國(guó)研究的熱點(diǎn)之一[4-7]。

稻草中碳水化合物（纖維素和半纖維素）含量較高，木質(zhì)素含量相對(duì)較低，是一種很有前景的生物乙醇生產(chǎn)原料[8-9]。從木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇一般需經(jīng)過(guò)預(yù)處理、酶解以及發(fā)酵三個(gè)過(guò)程，但由于纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素通過(guò)氫鍵、醚鍵以及酯鍵相互連接形成三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對(duì)微生物以及酶的降解呈高度抗性，因此，通過(guò)酶解發(fā)酵途徑利用稻草有效生產(chǎn)生物乙醇，必須對(duì)稻草進(jìn)行預(yù)處理。國(guó)內(nèi)外基于最高糖化效率建立的稻草預(yù)處理方式包括物理、化學(xué)以及生物方法，其中，化學(xué)方法中的堿預(yù)處理方式因可以選擇性去除木質(zhì)素以及溶解二氧化硅而使用最廣[10-12]。木質(zhì)纖維素的酶解需纖維素降解酶、半纖維素降解酶以及木質(zhì)素降解酶的協(xié)同作用。纖維素降解酶以及半纖維素降解酶可以分別將纖維素和半纖維素降解為相應(yīng)單糖，而木質(zhì)素降解酶則降解木質(zhì)素以及預(yù)處理過(guò)程中產(chǎn)生的木質(zhì)素部分降解產(chǎn)物。

為解決這些商業(yè)酶的高成本嚴(yán)重阻礙有效利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇的問(wèn)題，本研究將酶的生產(chǎn)、糖化和解毒結(jié)合在一個(gè)系統(tǒng)中，以碳酸鈉預(yù)處理的稻草作為唯一碳源，硫酸銨作為氮源，采用煙曲霉酶解稻草，采用嗜鞣管囊酵母對(duì)酶解產(chǎn)生的還原糖進(jìn)行發(fā)酵以生產(chǎn)乙醇。與同步糖化發(fā)酵（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）相比，該工藝進(jìn)一步強(qiáng)化，避免了酶的分離和純化，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了脫木質(zhì)素和解毒，可顯著降低糖化成本，提高生物乙醇的產(chǎn)率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

稻草：源自河南省信陽(yáng)市農(nóng)家，自來(lái)水洗滌后風(fēng)干至恒質(zhì)量，小型粉碎機(jī)粉碎后過(guò)20目篩，密封袋封裝保存于室溫備用。

煙曲霉（Aspergillus fumigatus）：從霉變稻草中篩選獲得并以孢子形式保存于本實(shí)驗(yàn)室；嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannophilus）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）1770。

1.1.2 培養(yǎng)基

煙曲霉種子培養(yǎng)基[13]：蔗糖10 g/L，硝酸鈉3 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，氯化鉀0.5 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，自然pH，121 ℃條件下滅菌20 min。

酵母種子培養(yǎng)基[14]：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖12 g/L，木糖8 g/L，自然pH，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.1.3 試劑

2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2-diazobis（3-ethyl-benzothiazole-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）、藜蘆醇、對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷、樺木木聚糖、愈創(chuàng)木酚（均為分析純）：德國(guó)Sigma Aldlich公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM-30R高壓蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；XY-ZDL-2102C回轉(zhuǎn)式搖床：上海昕?jī)x儀器儀表有限公司；UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；5804R型離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子液的制備

將煙曲霉孢子懸液（1.0×108CFU/mL）1 mL接種于種子培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h作為種子液（2×107CFU/mL）備用。

取1環(huán)嗜鞣管囊酵母于酵母種子培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min條件下活化24 h作為種子液（2×107CFU/mL）備用。

1.3.2 稻草預(yù)處理

在裝有10g稻草粉的500mL三角瓶中加入90mL0.15mol/L Na2CO3溶液，在121 ℃條件下滅菌20 min，蒸餾水代替碳酸鈉作相同處理作為對(duì)照，研究碳酸鈉預(yù)處理對(duì)稻草組分的影響。

1.3.3 酶解工藝

采用10 mol/L無(wú)菌硫酸或NaOH將預(yù)處理稻草的初始pH值分別調(diào)節(jié)為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0后，加入無(wú)菌50%硫酸銨溶液至其終濃度為1%，按照2%（V/V）的接種量接入煙曲霉種子液，于37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)，定時(shí)取樣，于1 230×g、4 ℃條件下離心10 min，取上清液測(cè)定酶活、還原糖、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、總酚以及稻草降解率。在此基礎(chǔ)上，以稻草降解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)考察煙曲霉接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）對(duì)酶解效果的影響。以滅活煙曲霉種子作為對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 乙醇生產(chǎn)工藝

接入煙曲霉種子液酶解12 h后，按4%（V/V）的接種量接入嗜鞣管囊酵母種子液，于37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，每隔一定時(shí)間取樣，于1 230×g、4 ℃條件下離心10 min，取上清液，測(cè)定乙醇含量。以乙醇含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察嗜鞣管囊酵母接種量（1%、2%、3%、4%、5%和6%）、接種時(shí)間（酶解12 h、16 h、20 h和24 h時(shí)接入酵母）對(duì)乙醇生產(chǎn)的影響。以滅活嗜鞣管囊酵母種子液作為對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 分析檢測(cè)方法

相對(duì)酚濃度[13]：定義煙曲霉接入前的初始酚濃度為100%，接入菌種酶解后的酚濃度與初始濃度之比即為相對(duì)酚濃度；漆酶酶活、錳依賴過(guò)氧化物酶酶活、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶酶活測(cè)定：參照文獻(xiàn)[14]；濾紙酶活、內(nèi)切纖維素酶酶活以及β-葡萄糖苷酶酶活測(cè)定：參照文獻(xiàn)[15]；木聚糖酶酶活以及木糖苷酶酶活測(cè)定：參照文獻(xiàn)[16]；稻草中纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素含量的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[17]；總酚含量的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[18]。

稻草降解率的計(jì)算公式如下：

式中：mB和mt分別為對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組中殘留稻草質(zhì)量，g。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理方法

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳酸鈉預(yù)處理對(duì)稻草組分的影響

堿預(yù)處理木質(zhì)纖維素因選擇性好，產(chǎn)生的酶解、發(fā)酵抑制物少，條件溫和，故廣泛被使用。Na2CO3預(yù)處理前后稻草主要組分見(jiàn)表1。

表1 Na2CO3預(yù)處理對(duì)稻草主要組分的影響Table 1 Effect of Na2CO3 pretreatment on the main components of rice straw

由表1可知，稻草經(jīng)過(guò)蒸餾水預(yù)處理后，稻草主要組分含量沒(méi)有顯著性變化（P＞0.05）。然而，稻草經(jīng)過(guò)0.15 mol/L碳酸鈉預(yù)處理后，纖維素及半纖維素含量顯著提高（P＜0.05），分別為（64.30±1.49）%、（33.50±0.68）%，而木質(zhì)素含量（1.95±0.03）%顯著減少（P＜0.05），這是因?yàn)樘妓徕c選擇性地?cái)嗔涯举|(zhì)素與半纖維素間的?；瑥亩鴮?dǎo)致木質(zhì)素的脫除，并不降解纖維素和半纖維素[2，19]。說(shuō)明碳酸鈉預(yù)處理稻草具有高度選擇性。

2.2 酶解工藝優(yōu)化

2.2.1 初始pH值對(duì)煙曲霉降解堿預(yù)處理稻草的影響

由于pH值既影響微生物的生長(zhǎng)又影響酶的分泌以及酶活，故pH值是發(fā)酵過(guò)程十分關(guān)鍵的因素之一[20]。初始pH值對(duì)煙曲霉降解堿預(yù)處理稻草的影響見(jiàn)圖1。

圖1 初始pH值對(duì)煙曲霉降解稻草的影響Fig.1 Effect of initial pH on rice straw degradation by Aspergillus fumigatus

由圖1可知，隨著初始pH值的升高，稻草降解率呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)初始pH值為4.5時(shí)，稻草降解率最高，為（100±2.13）%，說(shuō)明煙曲霉在初始pH值為4.5時(shí)可以完全降解碳酸鈉預(yù)處理的稻草。這可能是因?yàn)槔w維素降解酶以及半纖維素降解酶的最適pH值為4.5。

2.2.2 煙曲霉接種量對(duì)堿預(yù)處理稻草降解的影響

接種量在酶的生產(chǎn)中起著至關(guān)重要的作用，為了獲得最大的生產(chǎn)力，需要在底物利用和微生物繁殖之間取得平衡[21]。煙曲霉接種量對(duì)堿預(yù)處理稻草降解的影響見(jiàn)圖2。

圖2 煙曲霉接種量對(duì)稻草降解的影響Fig.2 Effect of inoculum on the degradation of rice straw by Aspergillus fimigatus

由圖2可知，隨著煙曲霉接種量的增大，稻草降解率呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)煙曲霉接種量為4%時(shí)，稻草降解率最高，達(dá)（100±2.13）%，分析原因可能是過(guò)低的接種量因預(yù)處理過(guò)程中產(chǎn)生的木質(zhì)素降解產(chǎn)物酚類物質(zhì)的抑制不利于煙曲霉的生長(zhǎng)，而過(guò)高的接種量則導(dǎo)致微生物競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而不利于稻草的降解[21]。

2.3 最優(yōu)酶解條件下酶活、還原糖及相對(duì)酚濃度的變化

在煙曲霉降解堿預(yù)處理稻草過(guò)程中，檢測(cè)到了所有纖維素降解酶（濾紙酶、內(nèi)切纖維素酶以及β-葡萄糖苷酶）和半纖維素降解酶（木聚糖酶以及木糖苷酶），而木質(zhì)素降解酶（漆酶、錳依賴過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶）則僅檢測(cè)到漆酶，并未產(chǎn)生錳依賴過(guò)氧化物酶以及木質(zhì)素過(guò)氧化物酶。在最優(yōu)酶解條件下，上清液的酶活、還原糖及相對(duì)酚濃度變化情況見(jiàn)圖3。

圖3 最優(yōu)酶解條件下酶活、還原糖以及相對(duì)酚濃度隨酶解時(shí)間變化曲線Fig.3 Change curves of enzyme activity,reducing sugar and relative phenol concentration under the optimal enzymatic conditions with enzymatic hydrolysis time

因酶解過(guò)程中未檢測(cè)到錳依賴過(guò)氧化物酶酶活以及木質(zhì)素過(guò)氧化物酶酶活，故圖中木質(zhì)素降解酶酶活僅顯示漆酶酶活。由圖3可知，木聚糖酶酶活、β-木糖苷酶酶活以及漆酶酶活均在接入煙曲霉發(fā)酵12 h后達(dá)到最大值，分別為（540.28±10.15）U/mL、（480.67±10.26）U/mL、（365.87±9.68）U/mL。而降解纖維素的內(nèi)切纖維素酶酶活、β-木糖苷酶酶活以及濾紙酶酶活均在接入煙曲霉發(fā)酵16 h后達(dá)到最大值，分別為（322.16±8.75）U/mL、（67.24±1.32）U/mL、（213.45±5.26）U/mL。這可能是因?yàn)樘妓徕c預(yù)處理時(shí)的木質(zhì)素降解產(chǎn)物酚類誘導(dǎo)漆酶的產(chǎn)生，半纖維素較纖維素更容易降解之故[19]。酶活達(dá)到最大值后均略有降低，但直到24 h，均維持較高酶活。這可能是酵母穩(wěn)定生長(zhǎng)階段產(chǎn)生的蛋白酶或其他抑制性代謝物使得酶分解或失活[18]。相對(duì)酚濃度隨著煙曲霉的接入顯著降低（P＜0.05），分析原因可能是煙曲霉產(chǎn)生的漆酶降解了酚類物質(zhì)，還原糖含量則逐漸增加，酶解24 h時(shí)，達(dá)到最大，為（52.36±1.23）g/L。分析原因可能是煙曲霉產(chǎn)生的漆酶可以有效降低碳酸鈉預(yù)處理以及煙曲霉自身酶解過(guò)程產(chǎn)生的酚類物質(zhì)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基起到脫毒作用，可以促進(jìn)纖維素降解酶以及半纖維素降解酶對(duì)纖維素和半纖維素的酶解[22]。

2.4 乙醇生產(chǎn)工藝優(yōu)化

2.4.1 嗜鞣管囊酵母接入時(shí)間對(duì)乙醇生產(chǎn)的影響

考慮到碳酸鈉預(yù)處理稻草選擇性去除木質(zhì)素和二氧化硅，而對(duì)碳水化合物基本無(wú)影響，且半纖維素以及纖維素降解酶酶活則分別在接入煙曲霉12 h以及16 h時(shí)達(dá)最大值，故在接入煙曲霉12 h、16 h、20 h以及24 h時(shí)按2%的接種量接入嗜鞣管囊酵母種子液，于37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)，考察嗜鞣管囊酵母接入時(shí)間對(duì)乙醇生產(chǎn)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 嗜鞣管囊酵母接種時(shí)間對(duì)乙醇生產(chǎn)的影響Fig.4 Effect of Saccharomyces tannophilus inoculation time on ethanol production

由圖4可知，嗜鞣管囊酵母在不同酶解時(shí)間接入，乙醇含量均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，發(fā)酵16 h時(shí)，終乙醇含量最高，分別為（26.3±0.4）g/L、（26.4±0.5）g/L、（26.2±0.4）g/L、（25.9±0.3）g/L，但不同接入時(shí)間點(diǎn)的最高乙醇含量沒(méi)有顯著性的差異（P＞0.05）。分析原因可能是酶解12 h時(shí)，體系中酚類物質(zhì)濃度較高，對(duì)乙醇生產(chǎn)有一定抑制作用，而酶解24 h時(shí)，則因稻草完全降解，體系中還原糖濃度較高，可能產(chǎn)生底物抑制。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，酶解12 h時(shí)接入嗜鞣管囊酵母更為有利。本研究的稻草降解速率以及乙醇含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于呂繼良等[23]采用綠色木霉（Trichoderma viride）和污泥發(fā)酵稻草生產(chǎn)乙醇。發(fā)酵所需時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于袁辛銳等[24]采用生香酵母和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發(fā)酵桂圓生產(chǎn)果酒的6 d。

2.4.2 嗜鞣管囊酵母接種量對(duì)乙醇生產(chǎn)的影響

嗜鞣管囊酵母接種量對(duì)乙醇生產(chǎn)至關(guān)重要，接種量過(guò)少，導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，接種量過(guò)多，則因維持菌體生長(zhǎng)消耗的還原糖過(guò)多，均可導(dǎo)致終乙醇含量降低，因此，研究了嗜鞣管囊酵母接種量對(duì)乙醇生產(chǎn)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 嗜鞣管囊酵母接種量對(duì)乙醇生產(chǎn)的影響Fig.5 Effect of Saccharomyces tannophilus inoculum on ethanol production

由圖5可知，不同嗜鞣管囊酵母接種量條件下，乙醇含量均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，發(fā)酵16 h時(shí)，終乙醇含量最高。隨著嗜鞣管囊酵母接種量的增大，乙醇含量呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)嗜鞣管囊酵母接種量為2%時(shí)，乙醇含量最高，發(fā)酵16 h時(shí)，最高乙醇含量為（26.30±0.86）g/L，因此，確定最佳嗜鞣管囊酵母接種量為2%。

3 結(jié)論

本研究選用煙曲霉和嗜鞣管囊酵母降解碳酸鈉預(yù)處理的稻草生產(chǎn)生物乙醇，煙曲霉酶解稻草、酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的最優(yōu)工藝為10 g稻草經(jīng)90 mL 0.15 mol/L碳酸鈉預(yù)處理后，調(diào)節(jié)pH值為4.5，按4%（V/V）的接種量接入煙曲霉種子液，于37 ℃、150 r/min條件下酶解12 h后，按2%（V/V）的接種量接入嗜鞣管囊酵母種子液，于37 ℃、150 r/min條件下發(fā)酵16 h，乙醇產(chǎn)量達(dá)到最高為（26.30±0.86）g/L。