張建云，谷立坤，彭 更，史永勝，趙維文，崔方凱，臧亞奇

（1.河南工程學院 環(huán)境與生物工程學院，河南 鄭州 451191；2.河南工程學院 煤化工資源綜合利用與污染治理河南省工程實驗室，河南 鄭州 451191）

甲醇是一種重要的有機化工基礎原料。甲醇可采用多種原料（如天然氣、煤炭、油、乙炔尾氣等）進行生產(chǎn)，世界甲醇生產(chǎn)以天然氣為主，我國以煤炭為主[1]。目前，煤制甲醇的合成技術比較成熟，隨著煤化工行業(yè)的快速發(fā)展，大型甲醇裝置相繼投產(chǎn)，甲醇成本日趨降低，我國的甲醇產(chǎn)能已經(jīng)超過5 000萬t/年，并呈繼續(xù)增加趨勢。然而國內的甲醇需求量不足一半，導致產(chǎn)能過剩[2-3]。因此，急需開發(fā)甲醇下游產(chǎn)品[4]。

甲基營養(yǎng)菌指的能夠利用甲基化合物為唯一的碳源和能源進行生長的一類微生物，能夠將自然界取之不盡、用之不竭的一碳化合物變?yōu)樘荚春湍茉矗〒?jù)估計，每年大概有83～273百萬t甲醇，600百萬t甲烷釋放到大氣中[6]），可以解決發(fā)酵過程中糖原料的限制并且擴大石化原料的應用范圍，因此對甲基營養(yǎng)型微生物的代謝研究具有重大意義。甲醇利用菌屬于甲基營養(yǎng)型細菌，比甲烷氧化菌更容易培養(yǎng)，可以利用甲醇獲取能量并轉化為蛋白和各種次生代謝產(chǎn)物包括輔酶、維生素B12、吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quineone，PQQ）、絲氨酸、聚-β-羥丁酸（poly-β-hydroxybu tyrate，PHB）、類胡蘿卜素等，這些產(chǎn)物可以作為藥物、食品添加劑、生物防治菌劑，具有良好的應用前景。目前相對比較成熟的技術是飼料用甲醇蛋白[7]，南京工業(yè)大學生物化工技術中心選育了生產(chǎn)甲醇蛋白的菌種，并通過實驗室小試；達到1 t/年及5 t/年的產(chǎn)量規(guī)模[8]。義煤集團以畢赤酵母YM-SCP02作為生產(chǎn)菌種，得到的甲醇蛋白最高產(chǎn)量（細胞干質量）為19.3 g/L[9]。以甲醇為碳源的畢赤酵母表達系統(tǒng)已表達出了數(shù)以千計的外源蛋白，且已經(jīng)有大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)的發(fā)酵工藝，表達重組蛋白時，已成功放大到10 000 L[10]。還有一些能以甲醇為唯一碳源進行生長的微生物體能夠分泌附加值較高的生物活性物質[11]，如：吡咯喹啉醌[12-15]、氨基酸[16-18]、維生素[19]、多糖[20]、有機酸類[21-22]等。由于甲醇的可生化性比較強，甲醇利用菌在含甲醇的工業(yè)廢水的處理方面也有一定的應用價值[23-26]，李寶慶等[23]篩選到一株甲醇利用菌對500 mg/L甲醇的降解率可達到97.75%，孔慶勝等[24]篩選的菌株SMD11對0.6%（V/V）甲醇的降解率為82.5%，田丹丹等[25]篩選的甲醇利用菌WGM16在60 h時對1%（V/V）甲醇的降解率為75%。

目前國內甲醇蛋白及相關生化產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化尚處于起步階段，很多關鍵性技術如發(fā)酵成本的降低，優(yōu)質高效菌種的選育，提取工藝的優(yōu)化等問題亟待探索研究。本研究從氣化廠的甲醇車間分離純化甲醇利用菌，并建立相關的微生物資源庫，旨在為利用微生物資源開發(fā)甲醇下游生化產(chǎn)品提供理論依據(jù)和新的實驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

沿河南氣化廠甲醇生產(chǎn)線地下排污管道監(jiān)測口挖取10～15 cm深度的土樣，共得到7個土樣，將采集的樣品放于統(tǒng)一的樣品袋中，做好標記并編號。

1.1.2 化學試劑

甲醇、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸銨、硝酸鉀（均為分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司；硫酸鎂、氯化鈣、氯化鈉（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、GoldView I核酸染色劑：北京索萊寶科技有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、細菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

無機鹽液體培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀7.5 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，無水氯化鈣0.015 g/L，氯化鈉0.5 g/L，硫酸銨2.0 g/L，加蒸餾水1 L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

無機鹽固體培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀7.5 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，無水氯化鈣0.015 g/L，氯化鈉0.5 g/L，硫酸銨2.0 g/L，瓊脂粉20 g/L，加蒸餾水1 L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

PHS-25B型數(shù)字酸度計：上海大普儀器有限公司；752N紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；HC-2064高速臺式離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；LDZM-60KCS-II立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；FA2204B電子天平：上海天美天平儀器有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱、THZ-300臺式恒溫搖床：上海一恒科學儀器有限公司；FC多功能酶標儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；XSP-2CA雙目生物顯微鏡：上海巴拓儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甲醇利用菌的富集、分離

配制500 mL無機鹽培養(yǎng)基分別移取50 mL培養(yǎng)基在8個滅菌的250 mL錐形瓶中，標號1～8，再分別稱取1～7號土樣各0.5～1.0 g投入對應編號的錐形瓶中，以8號瓶作無菌對照。將8份樣品分別添加2%（V/V）甲醇為碳源，恒溫（34 ℃、180 r/min）富集培養(yǎng)48 h，第二天補加2%（V/V）甲醇，轉接2次（每次培養(yǎng)48 h）。

菌液富集培養(yǎng)完成后，分別取1～8號錐形瓶中少量菌液，均勻涂布于含1.5%甲醇（V/V）的無機鹽固體培養(yǎng)基表面，34 ℃倒置培養(yǎng)，每天觀察菌落的生長情況（8號平板作為空白對照）。

1.3.2 甲醇利用菌的分離純化

待1～7號培養(yǎng)基中明顯觀察到菌體生長后，挑取生長速度快的菌體轉接到含1.5%（V/V）甲醇的無機鹽固體培養(yǎng)基上，等細菌長好再次轉接。第三次轉接從第二次轉接的平板上挑取菌體進行平板劃線分離純化，待長好后挑取劃線平板上的明顯的單菌落進行再一次劃線分離純化。挑取平生長狀態(tài)好的單菌落轉接斜面培養(yǎng)基進行培養(yǎng)（每個單菌落轉接3份斜面），等斜面培養(yǎng)基上的菌體長好后放在4 ℃冷藏，備用。

1.3.3 菌株形態(tài)學觀察和生理生化鑒定

將分離獲得的生長優(yōu)勢菌株劃線接種于含1%（V/V）甲醇的無機鹽固體培養(yǎng)基中，34 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落形態(tài)、色澤、質地等；挑取待測菌株苔進行革蘭氏染色，采用10×100油鏡，觀察菌體細胞形態(tài)。細菌生理生化鑒定主要參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[27]，生理生化鑒定用試劑的配制方法主要參考文獻[28]。

1.3.4 菌株的分子生物學鑒定

分子生物學鑒定采用16S rDNA基因序列分析法。

細菌總DNA 的提取：采用細菌基因組DNA 提取試劑盒進行提取，方法參考試劑盒說明書。

16S rDNA 基因序列的擴增：擴增引物（上游引物：27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，下游引物：1492R：5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'），PCR擴增條件為94 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火l min，72 ℃延伸1 min（30個循環(huán)）；最后在72 ℃下再延伸10 min。

16S rDNA基因序列的測序及分析：將擴增得到的16S rDNA基因序列由北京博邁德公司測序。測序結果在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）程序進行序列比對，并使用MEGA軟件（Version 5.1）中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建微生物系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.5 分析檢測

（1）菌體生長量的測定

從平板上挑取單菌落，接種于1.0%（V/V）甲醇為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基中，34 ℃、180 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，菌體的生長量采用分光光度法測定，以波長600 nm處的光密度來表示，測定時以空白培養(yǎng)基作為參比。

（2）甲醇降解率的測定

用變色酸分光光度法對樣品中殘留的甲醇含量進行測定，參考余波等[29-30]的方法并略加改進。

a、標準曲線的繪制

分別取0.5%甲醇標準溶液0、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL、24 μL、28 μL、32 μL、36 μL、40 μL于4 mL離心管中用40 μL蒸餾水作為空白實驗組，加入0.4 mL 25%的硫酸溶液，再加入0.2 mL 1%的高錳酸鉀溶液，充分搖勻后室溫放置5 min；加入0.2 mL亞硫酸鈉溶液，搖勻，加入2 mL濃硫酸，搖勻后冷卻至室溫；加入0.2 mL 0.5%變色酸溶液，搖勻后在沸水中加熱20min后，取出冷卻至室溫并定容至4mL，用分光光度計測定在波長574 nm下的吸光度值，并對不同甲醇繪制標準曲線。

b、培養(yǎng)液中甲醇殘留量的測定

定量接種菌株4311的對數(shù)期培養(yǎng)物于以甲醇為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)，定時取樣200 μL培養(yǎng)液，12 000 r/min離心5 min，取40 μL上清液按上述方法進行測定，并帶入標準曲線回歸方程計算甲醇含量。

c、甲醇降解率的計算[31]

甲醇降解率的計算公式如下：

式中：X為甲醇的生物降解率，%；Cm為未接菌對照培養(yǎng)液中甲醇的體積分數(shù)，%；Cn為接菌處理培養(yǎng)液中甲醇的體積分數(shù)，%。

1.3.6 菌株生長條件和降解條件的優(yōu)化

以甲醇體積分數(shù)、初始pH值、NaCl質量分數(shù)、氮源及最佳氮源添加量為影響因素，分別以菌體生長量及甲醇殘留量為評價指標，考查菌株在不同培養(yǎng)條件下的生長和降解甲醇情況。

（1）甲醇體積分數(shù)的確定

將對數(shù)期培養(yǎng)物接種于甲醇體積分數(shù)分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的液體培養(yǎng)基中，同時以一組未接菌的培養(yǎng)基作為對照，于34 ℃、180 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。定時取樣測量其OD600nm值和甲醇含量，考察甲醇體積分數(shù)對菌株生長和降解甲醇的影響。

（2）初始pH值的測定

將對數(shù)期培養(yǎng)物接種于以1.0%（V/V）甲醇為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基中，初始pH值分別調為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，于34 ℃、180 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。定時取樣測量其OD600nm值和甲醇含量，考察初始pH值對菌株生長和降解甲醇的影響。

（3）NaCl質量分數(shù)的確定

將對數(shù)期培養(yǎng)物接種于以1.0%（V/V）甲醇為唯一碳源，NaCl質量濃度分別為0.05%、0.50%、1.00%、2.00%、3.00%的無機鹽液體培養(yǎng)基中，于34 ℃、180 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。定時取樣測量其OD600nm值和甲醇含量，考察NaCl質量分數(shù)對菌株生長和降解甲醇的影響。

（4）氮源的確定

將對數(shù)期培養(yǎng)物接種于以1.0%（V/V）甲醇為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的氮源分別為硝酸鉀、硫酸銨、蛋白胨、尿素，氮源添加量為2.0 g/L，于34 ℃、180 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。定時取樣測量其OD600nm值和甲醇含量，考察氮源種類對菌株生長和降解甲醇的影響。

（5）氮源添加量的確定

將對數(shù)期培養(yǎng)物接種于以1.0%（V/V）甲醇為唯一碳源無機鹽液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中蛋白胨的添加量為0.5 g/L、2.0 g/L、4.0 g/L、6.0 g/L、8.0 g/L、10.0 g/L，于34 ℃、180 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。定時取樣測量OD600nm值和甲醇含量，考察氮源添加量對菌株生長和降解甲醇的影響。

1.3.6 菌株4311對不同濃度甲醇降解率的測定

在上述甲醇降解條件優(yōu)化的工作基礎上，將對數(shù)期培養(yǎng)物接種分別接種于以1.0%（V/V）和0.5%（V/V）甲醇為唯一碳源無機鹽液體培養(yǎng)基中，按照最適條件進行接種培養(yǎng)，定時取樣，采用變色酸分光光度法測定培養(yǎng)基內殘留甲醇的含量，同時以未接種的無機鹽液體培養(yǎng)基做為對照，計算甲醇的生物降解率，繪制甲醇降解曲線，考察菌株4311在優(yōu)化后的條件下對不同濃度甲醇的降解能力。

2 結果與分析

2.1 菌株4311的鑒定

2.1.1 菌株4311的菌落和菌體形態(tài)觀察

通過反復傳代篩選，從7個土樣中最終共篩選到16株能在1.5%（V/V）甲醇為唯一碳源無機鹽固體培養(yǎng)基平板上快速生長的菌株，保藏于斜面培養(yǎng)基上，每個菌株保藏3份，共48份。4311是從4號土樣中，第3批篩選出來的編號為1號的菌株。將斜面保藏的4311菌株在1.0%（V/V）甲醇為唯一碳源無機鹽固體培養(yǎng)基平板上劃線分離，34 ℃培養(yǎng)3～5 d，對菌株4311進行菌體、菌落形態(tài)觀察，結果見圖1。

圖1 菌株4311的菌落（A）和細胞（B）形態(tài)Fig.1 Colony(A) and cell (B) morphology of strain 4311

由圖1A可知，菌株4311的菌落呈白色，圓形，直徑范圍2～3 mm，中央隆起，邊緣整齊，表面光滑、濕潤。由圖1B可知，菌株4311革蘭氏染色為陰性，光學顯微鏡下觀察為短桿狀。

2.1.2 菌株4311的生理生化試驗

菌株4311能夠在以甲醇、甲胺為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基上生長，在LB培養(yǎng)基上生長狀態(tài)更好，對鏈霉素和卡鈉霉素敏感，對氨芐青霉素不敏感，不產(chǎn)色素，可以產(chǎn)吡咯喹啉醌PQQ，可以在pH值為5的培養(yǎng)基上生長，當NaCl含量＞1.00%時幾乎不生長。菌株4311的部分生理生化試驗鑒定結果見表1。

表1 菌株4311生理生化試驗鑒定結果Table 1 Results of physiological and biochemical experiments identification of strain 4311

2.1.3 菌株4311的分子生物學鑒定

由圖2可知，以細菌基因組DNA作為模板，以27F和1492R序列為引物，所擴增的16S rDNA的堿基片段大小在1.5 kb左右。對該16S rDNA片段序列進行測序，將測序后的結果提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，用BLAST工具進行同源性比較結果顯示，和菌株4311的16SrDNA序列同源性達到99%的有4株，同源性98%以上的有近20種，為甲基球形菌屬（Methylopila）的有15株菌，分屬于不同的種。其中Methylopila oligotropha最多，有4株。菌株4311系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。由圖3可知，菌株4311與Methylopila capsulatastrain IM1和Methylopila oligotrophastrain 2395A兩株菌具有最高的相似性，均為99%，與同屬的Methylopila jiangsuensisstrain JZL-4和MethylopilaYHT-1的相似性為98%，菌株4311與Methylopila capsulatastrain IM1聚為一個分支。

圖2 菌株4311 16S rDNA 的PCR擴增結果電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplification results of 16S rDNA of strain 4311

圖3 基于16S rDNA序列菌株4311的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain 4311 based on 16S rDNA sequence

綜合菌體特征和生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，菌株4311被鑒定為甲基球形菌屬（Methylopilasp.），該菌株屬于變形菌綱（Alphaproteobacteria），根瘤菌目（Rhizobiales），甲基包囊菌科（Methylocystaceae）。

2.2 甲醇標準曲線的繪制

由圖4可知，當甲醇體積分數(shù)在0～0.6%（V/V）時，甲醇體積分數(shù)與吸光度值線性相關性良好。其標準曲線線性回歸方程為y=3.058 4x-0.071 4，相關系數(shù)R2=0.993 4。

圖4 甲醇標準曲線Fig.4 Standard curve of methanol determination

2.3 不同影響因素對菌株4311生長和甲醇降解條件的影響

2.3.1 不同甲醇體積分數(shù)對菌株4311生長和甲醇降解的影響

由圖5A可知，當甲醇體積分數(shù)＜2.0%時，菌株4311基本不長，當甲醇體積分數(shù)為1.0%～1.5%時，菌株生長達到的峰值相近，OD600nm值為0.7左右，而在甲醇體積分數(shù)為1.0%時能更快進入對數(shù)期；當甲醇體積分數(shù)為0.5%時，在前40 h內生長速度較快，40 h以后生長速度變慢，說明在生長后期甲醇體積分數(shù)0.5%不能提供足夠的碳源供菌體生長。由圖5B可知，在甲醇體積分數(shù)0.5%的培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)基內甲醇含量從50～80 h之間有一個較大幅度的減少過程，而該時期菌株4311正處于對數(shù)生長期，對碳源需求量大；在甲醇體積分數(shù)為1.0%和1.5%的情況下，同樣有一個甲醇含量急劇降低的過程，其時間范圍均與對數(shù)生長期相對應；對于甲醇體積分數(shù)為2.0%的培養(yǎng)體系，幾乎沒有降解作用。綜合菌株生長及降解甲醇能力可知，菌株生長最適的甲醇體積分數(shù)為1.0%。

圖5 不同甲醇體積分數(shù)對菌株4311生長（A）及甲醇降解（B）的影響Fig.5 Effects of different methanol volume fraction on the growth (A)and methanol degradation (B) of strain 4311

2.3.2 不同初始pH值對菌株4311生長和甲醇降解的影響

由圖6A可知，與其他pH值相比，菌株4311在初始pH值5.0時生長情況最好，其他pH值時細菌生長情況明顯減弱，初始pH值為9.0時細菌的生長明顯受到抑制?？赡芘c菌體自身會分泌堿性物質中和酸性培養(yǎng)基有關，導致細菌在前20 h所有pH梯度都有生長，但初始pH 5.0條件下的菌株生長情況因受到抑制而生長較為緩慢。40 h以后，細菌分泌的堿性物質增多，使得培養(yǎng)基初始pH值越來越大，初始pH值為5.0條件下的菌株繼續(xù)生長，而其他條件時的菌株的生長受到抑制。由圖6B可知，對于菌株4311，在初始pH值為5.0～9.0，隨著pH的增大降解甲醇的速率而逐漸降低，在初始pH值為5的時候降解甲醇的速率最快，而且降解的最徹底。綜合菌株生長及降解甲醇能力，菌株4311最適生長的初始pH值為5.0。

圖6 不同初始pH值對菌株4311生長（A）及甲醇降解（B）的影響Fig.6 Effects of different initial pH value on the growth (A) and methanol degradation (B) of strain 4311

2.3.3 不同NaCl添加量對菌株4311生長和甲醇降解的影響

由圖7A可知，當NaCl質量分數(shù)為0.05%時，菌株4311的生長情況最好；當NaCl質量分數(shù)為0.50%時，生長狀態(tài)次之；當NaCl質量分數(shù)＞1.00%時，細菌活性極低，基本不生長。由圖7B可知，NaCl質量分數(shù)為0.05%時，菌株4311降解甲醇的能力最強，當NaCl質量分數(shù)為0.5%時降解能力次之。說明隨著鹽度的提高，菌株4311生長狀況變差，導致降解甲醇的能力變差。篩選到的甲醇利用菌4311耐鹽能力較差，當NaCl質量分數(shù)＞1%時，就不能正常生長。綜合菌株生長及降解甲醇能力，NaCl最適質量分數(shù)為0.05%。

圖7 不同NaCl質量分數(shù)對菌株4311生長（A）及甲醇降解（B）的影響Fig.7 Effects of different NaCl mass concentrations on the growth (A)and methanol degradation (B) of strain

2.3.4 不同氮源對菌株4311生長和甲醇降解的影響

氮源可用于合成細菌中的各種有機質，對于細菌的生長有著極其重要的作用，不同的氮源對細菌的影響也各不相同。由圖8A可知，菌株4311以蛋白胨為氮源時生長速度最快，其次是硫酸銨和硝酸鉀，而在尿素中生長最為緩慢，推測可能菌株4311體內脲酶分泌量低，不能很好的利用尿素做為氮源，相應地，當以蛋白胨為氮源時，菌株4311生長速度最快，其降解能力最強。沈壽國等[26]篩選出一株甲醇降解菌，其最適氮源為蛋白胨，其次是硫酸銨，在硝酸鉀中不生長，其結論與本研究的相近。

圖8 不同氮源對菌株4311生長（A）及甲醇降解（B）的影響Fig.8 Effects of different nitrogen sources on growth (A) and methanol degradation (B) of strain 4311

2.3.5 不同氮源添加量對菌株4311生長和甲醇降解的影響

由圖9A可知，蛋白胨添加量在0～10 g/L范圍內，蛋白胨添加量越高，菌體生長速度越快；當以10 g/L的蛋白胨為氮源時，菌體的OD600nm值在96 h可以達到1.1左右。在培養(yǎng)過程中，當以硫酸銨為氮源時，培養(yǎng)基中的菌體在培養(yǎng)4 d以后溶液出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，而以蛋白胨為氮源時，菌體聚集的現(xiàn)象會延遲1～2 d出現(xiàn)。由圖9B可知，當?shù)鞍纂颂砑恿繛? g/L，菌株4311降解能力最強，當?shù)鞍纂颂砑恿繛?.5 g/L，降解能力略次之。蛋白胨添加量為10 g/L時，菌株4311生長狀態(tài)最好，但降解能力最差，其原因可能是蛋白胨中含有碳源，會和甲醇起到競爭作用，影響到甲醇的利用。綜合菌株生長及降解甲醇能力，蛋白胨最適添加量為2 g/L。

圖9 不同蛋白胨添加量對菌株4311生長（A）及甲醇降解（B）的影響Fig.9 Effects of different peptone addition on growth (A) and methanol degradation (B) of strain 4311

3 結論

本研究從義馬氣化廠甲醇車間附近的土壤中篩選到一株甲醇利用菌4311。分析菌株的16S rDNA序列并結合其形態(tài)特征和生理生化特征，鑒定菌株4311為甲基球形菌屬（Methylopilasp.）。生長特性研究表明，該菌株的最適生長及降解條件為甲醇體積分數(shù)1.0%，初始pH 值5.0，氯化鈉質量分數(shù)0.05%，最適氮源為蛋白胨，其添加量為2 g/L。在此最佳培養(yǎng)條件下，1%（V/V）甲醇的降解率最高可以達到85%。