耿蒙慧 邢阿英 王大琳 胡艷秋

輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)的出現(xiàn)和發(fā)展為不孕不育癥患者帶來(lái)了孕育新生命的希望。然而，在過(guò)去近40年里，盡管試管嬰兒技術(shù)取得了長(zhǎng)足地發(fā)展，其成功率卻達(dá)到了一個(gè)瓶頸，徘徊在40%～50%左右。如何判斷胚胎的植入能力一直是胚胎學(xué)家們努力攻克的難題，近年來(lái)，評(píng)估、挑選胚胎的方法不斷發(fā)展，用無(wú)創(chuàng)性方法評(píng)估胚胎備受關(guān)注。胚胎的無(wú)創(chuàng)評(píng)估是指不影響胚胎的正常發(fā)育環(huán)境，不會(huì)對(duì)胚胎產(chǎn)生負(fù)面影響，不直接損傷胚胎的評(píng)估方法[1]。蛋白質(zhì)組學(xué)作為其中一種，能降低形態(tài)學(xué)評(píng)估來(lái)自不同人的主觀差異而前景可期。其研究發(fā)育中的胚胎產(chǎn)生和分泌的蛋白質(zhì)，以反映胚胎發(fā)育狀態(tài)，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)的規(guī)律。目前可通過(guò)質(zhì)譜法，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)及其他電離方法等，精確、快速、簡(jiǎn)便地測(cè)定微量樣品產(chǎn)生和分泌的蛋白質(zhì)含量。近年來(lái)，對(duì)于人類白細(xì)胞抗原G (human leukocyte antigen G，HLA-G)的研究較多，HLA-G作為一種免疫抑制因子而調(diào)節(jié)母胎界面和母體的免疫反應(yīng)，從而防止母胎免疫排斥的發(fā)生[2]。研究表明，HLA-G是評(píng)估胚胎質(zhì)量的重要標(biāo)志物[3]。胚胎培養(yǎng)液中可溶性HLA-G(soluble human leukocyte antigen G，sHLA-G)的存在有利于較高的胚胎植入率和妊娠率[4]。本文回顧性分析了胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G與胚胎植入和妊娠的相關(guān)性，為胚胎質(zhì)量的評(píng)判提供依據(jù)。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

選擇2017年5月—2018年5月在江蘇省蘇北人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受體外受精或卵胞漿內(nèi)單精子注射胚胎移植(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，IVF/ICSI)的86例不孕患者，共計(jì)100個(gè)周期為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：女性年齡20～44歲、不孕年限≥1年、獲卵數(shù)≥1個(gè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：子宮異常(肌瘤、子宮腺肌癥、子宮縱膈、其它先天或后天子宮畸形)、子宮內(nèi)膜異位癥III或Ⅳ期、患者或其丈夫染色體異常及有內(nèi)科合并癥如甲狀腺功能異常、高泌乳素血癥和糖尿病等內(nèi)分泌疾病、供卵/凍卵周期、補(bǔ)救ICSI、移植兩個(gè)胚胎后獲得單胚胎植入的。獲取胚胎受精后第3日行胚胎冷凍的單個(gè)胚胎培養(yǎng)液共計(jì)146份。按妊娠結(jié)局分為妊娠組和未妊娠組；另按移植胚胎中sHLA-G陽(yáng)性情況分為2組：sHLA-G陽(yáng)性組和sHLA-G陰性組，比較組間差異。本研究遵循的程序符合江蘇省蘇北人民醫(yī)院倫理委員會(huì)制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，得到該委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、方法

1.胚胎及培養(yǎng)液的選擇：卵子取出后培養(yǎng)3～6 h加入處理后的精液，授精后20～21 h觀察受精情況，并將每個(gè)受精卵分別移入30 ulG1(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)液滴中蓋油，在37 ℃、6%CO2條件下孵育至移植前。胚胎分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)第三天胚胎形態(tài)和碎片多少，將胚胎分為4級(jí)：Ⅰ級(jí)：卵裂球大小均勻，胞質(zhì)無(wú)異常，碎片<5%；Ⅱ級(jí)：卵裂球大小均勻或不均勻，碎片<20%；Ⅲ級(jí)：碎片 20%～50%；Ⅳ級(jí)：碎片>50%；可移植胚胎包括Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)胚胎。

2.胚胎培養(yǎng)液的收集和保存：將每個(gè)胚胎對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液25 ul吸入0.5 mL Eppendrof管中，存放入-80 ℃冰箱以備檢測(cè)。

3.sHLA-G的檢測(cè)：采用雙抗體夾心法ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)試劑盒，定量檢測(cè)單個(gè)胚胎培養(yǎng)液sHLA-G濃度。sHLA-G試劑盒由捷克BioVendor Laboratory Medicine公司提供，試劑盒最低檢測(cè)限為1 ng/ml。一抗為鼠抗sHLA-G單克隆抗體，二抗為酶標(biāo)的鼠源抗人微球蛋白單克隆抗體。按說(shuō)明書(shū)操作。實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備有：Bio Tek Instruments(HIGHLAND PARK,BOX 998.WINOOSKI,VT 05404-0998,USA)光譜儀、微量振蕩器、水浴箱等。

4.胚胎的凍融移植：胚胎解凍后觀察，至少有6個(gè)細(xì)胞且細(xì)胞內(nèi)碎片少于20%的胚胎被認(rèn)為是可移植的，培養(yǎng)2 h后移植至宮腔內(nèi)，最多移植2個(gè)胚胎。移植后常規(guī)給予黃體酮40～80 mg肌內(nèi)注射，或陰道放置黃體酮陰道緩釋凝膠90 mg/d予以黃體支持。

5.確認(rèn)妊娠：胚胎移植后14天，若患者血清β-人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)陽(yáng)性，定義為生化妊娠；移植4～5周后，超聲檢查見(jiàn)孕囊或臨床證實(shí)為異位妊娠及宮內(nèi)外同時(shí)妊娠，則定義為臨床妊娠。

結(jié) 果

一、研究對(duì)象的一般資料

妊娠組與未妊娠組患者的年齡、不孕年限、不孕類型、BMI、授精方式、Gn天數(shù)、Gn總量、基礎(chǔ)性激素水平、HCG日子宮內(nèi)膜厚度比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；妊娠組的竇卵泡數(shù)、獲卵數(shù)及成熟卵數(shù)均較未妊娠組高(均P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 妊娠組與未妊娠組基本信息比較Table 1 Comparison of general characteristics of the pregnant group and non-pregnant

二、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)判讀

根據(jù)sHLA-G標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得sHLA-G濃度與吸光度(optical density，OD，450 nm)之間的線性回歸方程，由OD值推算各培養(yǎng)液中sHLA-G的含量，依據(jù)其妊娠結(jié)局做ROC曲線，曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.746(95% CI：0.661-0.831)(見(jiàn)圖1)。計(jì)算截?cái)嘀礱=1.253(靈敏度為69.2%，特異性為84.0%)，≥a則為 sHLA-G陽(yáng)性，

圖1 培養(yǎng)液中sHLA-G預(yù)測(cè)胚胎植入的ROC曲線Figure 1 ROC curve for estimating the predictive value of sHLA-G in embryo culture medium of embryo implantation

三、第三日單胚胎培養(yǎng)液sHLA-G表達(dá)情況

行FET的86例患者, 共100個(gè)周期，146個(gè)胚胎成功移植。其中獲得臨床妊娠的有38個(gè)周期，65個(gè)胚胎成功植入，81個(gè)胚胎未植入。臨床妊娠率為38.0%(38/100)，妊娠組與未妊娠組之間sHLA-G含量平均值的差異(1.8 U/mLvs 0.8 U/mL)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2；sHLA-G陽(yáng)性組植入率(77.6%，45/58)高于sHLA-G陰性組(22.7%，20/88)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); sHLA-G陽(yáng)性組平均sHLA-G濃度(2.4 U/mL)明顯高于sHLA-G陰性組(0.3 U/mL)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)表3；二元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G含量為影響胚胎植入的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表4。以植入與未植入胚胎的sHLA-G含量做散點(diǎn)圖，組間sHLA-G含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

表2 妊娠組與未妊娠組sHLA-G含量和植入率對(duì)比Table 2 Comparison of the mean value of sHLA-G and implantation rate between Pregnant Group and Non-pregnant Group

表3 sHLA-G陽(yáng)性組與sHLA-G陰性組含量及植入率對(duì)比Table 3 Comparison of thesHLA-G levels and implantation rate between sHLA-G positive group and sHLA-G negative group

表4 二元Logistic回歸分析變量對(duì)胚胎植入的影響Table 4 Binary logistic regression analysis of factors on the implantation of embryos

圖2 植入組與未植入組sHLA-G含量分布圖Figure 2 The scattergram of sHLA-G levels in implantation group and non-implantation group

討 論

自1978年第一例試管嬰兒誕生以來(lái)，通過(guò)技術(shù)的革新，問(wèn)題的突破及不斷的研究探索，輔助生殖技術(shù)在胚胎學(xué)家們的努力下持續(xù)發(fā)展，為人類造福。但仍存在一些亟需解決的問(wèn)題，最主要是“一低一高”問(wèn)題，即活產(chǎn)率低和多胎妊娠率高，為解決這個(gè)問(wèn)題，更準(zhǔn)確的評(píng)估胚胎發(fā)育潛能，挑選單個(gè)最優(yōu)胚胎進(jìn)行移植很重要。為了尋求無(wú)創(chuàng)，簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確的評(píng)估方法，本研究通過(guò)分析植入與未植入胚胎的胚胎培養(yǎng)液中的sHLA-G含量，探討其是否可作為妊娠預(yù)測(cè)指標(biāo)。首先從理論上來(lái)說(shuō)：1996年Jurisicova等第一次研究證明了sHLA-G陽(yáng)性胚胎的卵裂率更高，且sHLA-G的表達(dá)與胚胎植入存在正相關(guān)[4]，從此以后，許多研究者發(fā)表了關(guān)于胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G的表達(dá)與胚胎妊娠結(jié)局關(guān)系的研究。Sher等的一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究表明，胚胎在ICSI后46小時(shí)能產(chǎn)生sHLA-G預(yù)示著較好的妊娠結(jié)局[5]。德國(guó)的一項(xiàng)多中心研究表明，隨著胚胎發(fā)育階段的推進(jìn)，sHLA-G陽(yáng)性胚胎的比例隨之升高，且sHLA-G陽(yáng)性胚胎發(fā)育至囊胚的可能性更大，sHLA-G水平可能是繼胚胎的形態(tài)學(xué)評(píng)分系統(tǒng)之后的第二個(gè)重要評(píng)判參考[6]。2017年發(fā)表的一篇薈萃分析表明胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G的存在有利于較高的胚胎植入率和妊娠率[7]。其次從標(biāo)本的檢測(cè)方面來(lái)講：一方面，胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的直接環(huán)境是胚胎培養(yǎng)液，胚胎從中汲取養(yǎng)分并分泌代謝產(chǎn)物。在基因——蛋白——代謝終產(chǎn)物這樣一個(gè)生物信息傳遞鏈中，蛋白質(zhì)及代謝物是細(xì)胞生命活動(dòng)的體現(xiàn)者，能反映胚胎的活力。另一方面，在一般情況下，第三天胚胎行移植或培養(yǎng)囊胚或冷凍保存后，卵裂期胚胎培養(yǎng)液均被遺棄，對(duì)其的收集及檢測(cè)既節(jié)約資源又對(duì)胚胎無(wú)任何損傷。

研究表明，HLA-G是人類主要組織相容性復(fù)合體，特異性表達(dá)于絨毛膜外細(xì)胞滋養(yǎng)層的母-胎界面，它除了能抑制NK細(xì)胞的自然殺傷和T淋巴細(xì)胞及抗原提呈細(xì)胞的免疫應(yīng)答作用，使絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞逃避殺傷，也可通過(guò)MEK1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)HCG的表達(dá)，促進(jìn)血管重塑及早期胚胎的著床和發(fā)育[8-9]。sHLA-G主要存在于早期胚胎的胚胎培養(yǎng)液中，羊水、母體血清、血漿和卵泡液中也可檢測(cè)到，已有多數(shù)研究結(jié)果提示，胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G的存在與較高的胚胎植入率和妊娠率有關(guān)[7]。有研究稱妊娠早期胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及子癇前期相關(guān)[10-11]，但它們之間的關(guān)系尚無(wú)定論，由此可見(jiàn)，探究sHLA-G與胚胎植入及妊娠并發(fā)癥之間的關(guān)系對(duì)于挑選優(yōu)質(zhì)胚胎，改善妊娠結(jié)局很有意義。

sHLA-G在胚胎培養(yǎng)液中的表達(dá)多為定量研究，以往的多數(shù)研究中，由于測(cè)定sHLA-G的方法不盡相同，使用的試劑盒及操作步驟有所區(qū)別，所以使用不同的判定方法來(lái)界定sHLA-G陽(yáng)性截?cái)嘀礫6,12,13]。部分研究將可檢測(cè)到sHLA-G定為陽(yáng)性，還有研究中直接給出陽(yáng)性的濃度范圍，但并未解釋范圍的來(lái)源，故這些方法降低了不同研究之間可比性。還有一部分研究用Stoller的非參數(shù)判別分析確定陽(yáng)性截?cái)嘀担创郎y(cè)胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescent intensity,MFI)高于陰性對(duì)照MFI的10%即為sHLA-G陽(yáng)性。由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境及試劑的不同，操作方法的差異使得不同研究之間的sHLA-G陽(yáng)性/陰性的標(biāo)準(zhǔn)不同，這大大降低了不同研究之間可比性，偏倚較大。本研究依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和培養(yǎng)液的sHLA-G的實(shí)際測(cè)定值來(lái)確定陰陽(yáng)，由ROC曲線來(lái)確定截?cái)嘀担啾绕渌芯糠椒?，其敏感性及特異性均較高，更加客觀地判定了sHLA-G陽(yáng)性的界限。截?cái)嘀凳清e(cuò)誤最少的最好閾值，其假陽(yáng)性和假陰性的總數(shù)最少。研究中ROC曲線下面積AUC為0.746，表明用胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G含量評(píng)估胚胎的植入結(jié)局有中等度準(zhǔn)確性。由于本研究樣本量不高，且為回顧性研究，偏倚不可避免，故而需加大樣本量進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

本研究中妊娠組sHLA-G含量均值高于非妊娠組；sHLA-G陽(yáng)性組的sHLA-G含量均值高于sHLA-G陰性組，表明用ELISA法檢測(cè)胚胎培養(yǎng)液中的sHLA-G是可行的。這與Noci等[12]的研究結(jié)果不同，他們認(rèn)為移植胚胎中至少要有一個(gè)是sHLA-G陽(yáng)性時(shí)才獲得妊娠，但多數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中妊娠組與非妊娠組胚胎均檢測(cè)到sHLA-G陽(yáng)性的表達(dá)[7]。究其原因，一方面是研究方法之間的差異，另一方面，有研究表明不同發(fā)育時(shí)間的胚胎產(chǎn)生sHLA-G的量不同，培養(yǎng)24h(52%)、培養(yǎng)48 h(87%)、培養(yǎng)72 h(90%)的胚胎有sHLA-G的表達(dá)[14]。雖然多數(shù)研究均檢測(cè)的是第三天的胚胎培養(yǎng)液，但胚胎發(fā)育速度的不同必將導(dǎo)致sHLA-G含量的差異。

二元Logistic回歸分析去除混雜因素后的結(jié)果表明，胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G含量為影響胚胎植入的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，證明了胚胎培養(yǎng)液中的sHLA-G與妊娠結(jié)局相關(guān)，它可能是預(yù)測(cè)胚胎質(zhì)量的一個(gè)標(biāo)志物，此結(jié)果與多數(shù)已發(fā)表的研究結(jié)果類似[7，15]。卵泡的發(fā)育將直接影響胚胎的質(zhì)量及妊娠結(jié)局[16]，本研究中，單因素分析中妊娠組的竇卵泡數(shù)、獲卵數(shù)及成熟卵數(shù)均高于未妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但二元Logistic回歸分析表明竇卵泡數(shù)、獲卵數(shù)及成熟卵數(shù)與妊娠結(jié)局的關(guān)系不大，進(jìn)而證明sHLA-G含量為影響胚胎植入的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究中收集并測(cè)定的是第三天的胚胎培養(yǎng)液中的sHLA-G含量，這些胚胎在第三天被冷凍，等待解凍后移植。這為評(píng)估胚胎質(zhì)量提供了一種新思路，為復(fù)蘇周期胚胎移植的質(zhì)量評(píng)估提供了新方法，爭(zhēng)取了時(shí)間。形態(tài)學(xué)評(píng)估法仍是臨床應(yīng)用最廣的胚胎質(zhì)量評(píng)估方法，因此，結(jié)合第三天胚胎的形態(tài)學(xué)評(píng)級(jí)及培養(yǎng)液中的sHLA-G含量挑選優(yōu)質(zhì)胚胎解凍移植，以提高胚胎植入率，是我們接下來(lái)的研究方向。

綜上所述，本研究結(jié)果表明可將胚胎培養(yǎng)液中的sHLA-G 水平檢測(cè)作為胚胎移植前無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)項(xiàng)目，促進(jìn)臨床中選擇性單胚胎移植的進(jìn)行。在形態(tài)學(xué)評(píng)估的基礎(chǔ)上，將sHLA-G作為輔助生育中無(wú)創(chuàng)檢測(cè)項(xiàng)目，幫助選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行單胚胎移植，可以在提高胚胎著床率的同時(shí)降低多胎率。但本研究的局限是納入研究的樣本較少，需要更大規(guī)模的前瞻性研究來(lái)證明sHLA-G對(duì)于評(píng)估胚胎質(zhì)量的可靠性。