于艷芳 魏芳

2018年全球185個國家中，宮頸癌新發(fā)病例569 847例，死亡病例311 365例，其發(fā)病率和死亡率在全球女性惡性腫瘤中均居第四位，且發(fā)展中國家宮頸癌發(fā)病率高于發(fā)達國家[1]。95%的宮頸癌是由高危型人乳頭瘤病毒(High risk human papillomaviruses，HR-HPV)持續(xù)感染引起。不同的HPV分子感染持續(xù)時間和致癌潛能不同，過去對此差異的研究以HPV類型為基礎(chǔ)，隨著基因組學的發(fā)展，逐漸認識到同一類型的HPV內(nèi)存在不同的變異譜系和亞系，且不同變異譜系和亞系的致癌潛能也有明顯的差異[2-4]。HR-HPV的免疫逃避機制導致其感染的持續(xù)性，HR-HPV通過癌蛋白E6和E7分別與p53和pRb結(jié)合發(fā)揮致癌的主要作用。此外，HR-HPV可以增加宿主細胞基因組的不穩(wěn)定性，導致體細胞突變的積累，以及通過其介導的載脂蛋白B mRNA編輯催化多肽(APOBEC)突變共同發(fā)揮致癌作用[5-6]。

一、HPV結(jié)構(gòu)

HPV是一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒，長度約8 000堿基對，含有8或9個開放閱讀框(ORFs)，包裹在無包膜衣殼蛋白內(nèi)。病毒基因可分為三個主要區(qū)域：(1)早期區(qū)域(E)。編碼病毒周期所必需的基因，并在細胞轉(zhuǎn)化中起重要作用(E1、E2、E4、E5、E6和E7)；(2)晚期區(qū)域(L)。編碼病毒顆粒的主要外殼蛋白L1和次要外殼蛋白L2；(3)上游調(diào)控區(qū)(URR)。也稱為長控制區(qū)(LCR)，是含有復制起點和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的非編碼區(qū)，通過控制病毒基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)DNA復制。盡管不同HPV分子ORF的大小和數(shù)量存在差異，但所有HPV都含有保守的核心基因參與復制(即E1和E2)和包裝(即L1和L2)，其余基因(即E4、E5、E6和E7)在驅(qū)動細胞周期、免疫逃逸和病毒釋放方面發(fā)揮作用。

二、HPV各水平分類

HPV是一個龐大的病毒家族，依據(jù)病毒基因遺傳差異其分類水平逐層向下依次是：屬、物種、類型、變異譜系和亞系[2-4]。HPV依據(jù)L1基因結(jié)構(gòu)和對人類上皮組織的趨向性不同分為五個屬：α-、ν-、μ-、β-和γ-屬，不同屬HPV病毒L1基因的核苷酸序列同一性<60%，其中導致宮頸癌的主要是α-HPV[2]。屬內(nèi)引入術(shù)語“物種”，同一物種HPV病毒L1基因的核苷酸序列同一性≥70%，如α-HPV又分α-1、α-2、α-3……α-14等14個物種[3]。同一物種內(nèi)，HPV病毒L1基因的核苷酸序列差異≥10%即定義為一種HPV類型，如α-7物種組內(nèi)有HPV18、HPV39、HPV45、HPV59、HPV68、HPV70、HPV85和HPV97，α-9物種組內(nèi)有HPV16、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52、HPV58和HPV67，目前已鑒定出200多種HPV類型[3]。HPV類型內(nèi)又存在不同變異體，即變異譜系和亞系，其內(nèi)部全部病毒基因組序列差異分別為1%～10%和0.5%～1%，以HPV16為例，迄今已鑒定出HPV16的4個變異譜系(A、B、C和D)和16個亞系，分別為：亞系A(chǔ)1-3(見于歐洲)、A4(亞洲)、B1-4(非洲)、C1-4(非洲)、D1(北美)、D2和D3(亞裔美國人)和D4[3-4]。

三、不同HPV分子致癌潛能不同

α-屬HPV中的一些HPV類型易感染粘膜上皮，并可能導致良性無癥狀感染、生殖器疣或?qū)m頸癌等多種疾病[2]。約60個α-HPV類型中，12個被WHO定義為I類致癌物，分別是α-9物種組中的HPV16、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52和HPV58，α-7物種組中的HPV18、HPV39、HPV45和HPV59，α-5物種組中的HPV51和α-6物種組中的HPV56[2]。一些研究表明，HPV的不同變異體在感染持續(xù)性、進展為宮頸癌前病變和癌癥方面具有不同風險。

HPV16是目前已知的最高危HPV類型，與大約50%的宮頸癌相關(guān)，感染HPV16非A變異譜系(即B、C和D)的女性發(fā)展為宮頸癌的風險比感染HPV16-A變異譜系的女性增高1倍[4]。HPV16亞系A(chǔ)4、D2和D3在宮頸原位腺癌(AIS)和腺癌(ADC)中更常見，而A1、A2亞系見于大多數(shù)(75.4%)宮頸鱗癌中[4]。2016年，美國科研工作者使用高通量HPV全基因組測序分析了3 215名感染HPV16婦女的HPV16變異譜系和亞系，分析其與宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變III級(CINIII)的風險，結(jié)果顯示：A4亞系癌癥風險較高，特別是腺癌，譜系B具有較低的CINIII風險，D2、D3亞系與CINIII和癌癥風險增加密切相關(guān)，D2具有最強的腺體病變風險[4]。表明HPV病毒較小的遺傳差異即能導致致癌潛能的變化。

HPV18存在3個變異譜系(A、B、C)和9個亞系(A1-5、B1-3、C)，HPV18 -A變異譜系(見于歐洲)導致CINIII的風險是B、C變異譜系(見于非洲)的2倍，亞系A(chǔ)1、A2導致腺癌的風險比亞系A(chǔ)3、A4高4倍[3]。

HPV31存在3個變異譜系(A、B、C)和7個亞系(A1-2、B1-2、C1-3)。目前關(guān)于HPV31變異體與感染持續(xù)性的關(guān)系尚有爭議，有報道認為HPV 31-C變異譜系比A、B變異譜系感染持續(xù)時間更長，亦有報道認為A和B譜系與持續(xù)感染和疾病進展相關(guān)，譜系B與CINIII關(guān)系密切[3]。

HPV52存在4個變異譜系(A、B、C和D)和7個亞系(A1-2、B1-2、C1-2和D)。來自臺灣的一項大型研究表明，譜系C在導致HSIL及以上級別的病變中風險是譜系B的7.6倍[7]。加拿大的一項研究表明A1亞系在CIN II/III中更為常見[8]。

變異體的研究對于解決HPV發(fā)病機制的遺傳基礎(chǔ)、病毒-宿主相互作用、導致特定組織病理癌癥的特定核苷酸或核苷酸組合等的研究意義重大，需要更多的多中心研究及薈萃分析來解決HPV相關(guān)癌癥核苷酸水平和分子水平的發(fā)病機制。

四、HPV生命周期及其免疫逃避機制

大多數(shù)肛門生殖器HPV感染是通過性接觸獲得的。既往認為HPV感染需要上皮創(chuàng)傷或微創(chuàng)傷以允許病毒進入基底層，并提出傷口愈合反應在受感染細胞增殖中的作用，隨著研究進展，鑒于HPV類型和感染途徑的多樣性，感染途徑不再一概而論，并認為在傷口愈合期間發(fā)生的活躍細胞增殖是病毒基因組進入細胞核所必需的[2]。HPV生命周期與受感染上皮細胞的分化程度密切相關(guān)，HR-HPV更易感染具有增殖能力的基底層細胞，其在一定程度上決定了HR-HPV感染的持續(xù)性，感染分兩個階段：潛伏感染和生產(chǎn)性感染[9]。在潛伏感染期間，病毒基因復制水平較低，每個細胞產(chǎn)生約50～100個病毒基因組，且病毒基因組存在于上皮細胞內(nèi)不向體液中釋放，故而逃避機體的免疫反應，這種現(xiàn)象在HR-HPV中更常見[5]。有體外研究表明HPV16表達由E1和E2開放閱讀框的亞區(qū)(稱為E8E2)編碼的融合蛋白，限制病毒在未分化的角質(zhì)形成細胞中完成病毒生命周期的轉(zhuǎn)錄和復制[10]。生產(chǎn)性感染階段，E6和E7高度表達，E2蛋白將E1(一種病毒DNA解旋酶)募集到病毒復制起點的結(jié)合位點，促進病毒DNA復制，導致在分化成熟的角質(zhì)形成細胞中每個細胞產(chǎn)生數(shù)千個病毒基因組拷貝[9]。在上皮細胞分化成熟后，HPV基因組編碼合成L1和L2衣殼蛋白，組裝成新的HPV顆粒從上皮表面釋放，使感染擴散[11]。

此外，HPV免疫逃避的機制還包括調(diào)節(jié)干擾素信號傳導、通過E6和E7癌蛋白抑制朗格漢斯細胞、抑制粘附分子如CDH1以及調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號傳導途徑等[12]。一半多的女性在HPV感染后的6個月內(nèi)可自行清除病毒，超過90%的感染女性在幾年內(nèi)可以清除，不會引起癥狀，即使產(chǎn)生癥狀大多數(shù)患者會自發(fā)消退，小部分HPV感染持續(xù)存在發(fā)展為癌癥。僅有極少數(shù)的患者在HPV自然感染后產(chǎn)生HPV抗體，但經(jīng)此途徑產(chǎn)生的抗體在抵抗新一輪的HPV感染時其有效性遠低于高水平血清反應和接種HPV疫苗后產(chǎn)生的抵抗力[13]。

五、HPV致癌機制

1.致癌基因激活和抑癌基因失活：HR-HPV編碼的E6癌蛋白與宿主細胞編碼的E6AP形成的復合體，與腫瘤抑制基因p53結(jié)合，使p53失活、降解，喪失與促凋亡bcl-2陰性調(diào)節(jié)區(qū)域和抗凋亡的bax促進子區(qū)域的結(jié)合能力，從而抑制凋亡，增加染色體不穩(wěn)定性，使細胞過度增殖導致腫瘤[11]。E7能與非磷酸化pRb優(yōu)先結(jié)合，使pRb-E2F發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用，經(jīng)過反饋環(huán)的增量調(diào)節(jié)引起p16INK4A過度表達，使控制細胞周期的轉(zhuǎn)錄脫調(diào)節(jié)，引起細胞過度增殖[11]。此外，E6能激活端粒酶活性，E7能使細胞周期失調(diào)、細胞增殖、增加基因組不穩(wěn)定性并促進染色體異常的積累，均可促進上皮細胞轉(zhuǎn)化[11]。

2.HPV整合與基因組不穩(wěn)定性：基因組不穩(wěn)定性的發(fā)展是HR-HPV致癌過程中惡性進展的標志。

HPV病毒基因與宿主基因的整合可能是輕度鱗狀細胞上皮內(nèi)瘤變向重度鱗狀細胞上皮內(nèi)瘤變進展的早期事件，因此可能是癌癥進展的生物標志物[14]。宮頸癌中HPV整合程度因HPV類型而異，與HPV16、18和45相比，HPV31和33的整合頻率較低，約74%的HPV16相關(guān)癌癥發(fā)生了基因整合，幾乎所有HPV18相關(guān)癌癥均發(fā)生了基因整合[6]。在HPV變異譜系水平上，研究發(fā)現(xiàn)不同變異譜系可能因E6活性不同，其整合潛力不同[6]。基因整合通常發(fā)生于DNA損傷后無法修復的染色體脆性位點，DNA損傷通常由活性氧、活性氮和HPV蛋白E1、E6和E7等誘導[15]。宿主細胞DNA損傷后，HPV癌蛋白通過多種方式對抗細胞的DNA損傷應答(DNA damage response，DDR)反應，使DNA斷點無法修復以利于病毒基因整合[16]。整合導致病毒基因E1、E2、E5和L2被破壞，E6和E7癌基因缺乏E2癌蛋白的抑制作用而過表達[17]。E6 / E7的過表達導致細胞周期的失調(diào)并促發(fā)幾條致癌途徑。

E6和E7通過干擾有絲分裂期間著絲粒的復制和誘導中心體數(shù)量異常，直接增加基因組不穩(wěn)定性，這可能導致大的染色體重排和拷貝數(shù)變異[18-19]。宮頸癌在癌癥基因組網(wǎng)絡(luò)圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)集中平均有88個基因拷貝數(shù)改變，包括26個擴增和37個丟失，擴增最常見于3q(50%的癌癥和25%的CINIII)，該區(qū)域含PIK3CA基因，丟失最常見于3p(40%的癌癥和10%的CINIII)[6]。宮頸鱗癌中報告的拷貝數(shù)變異多于宮頸腺癌[6]。研究表明，HPV相關(guān)的宮頸癌中，拷貝數(shù)變異通常發(fā)生在病毒整合位點[6]。

由E6和E7激活的致癌過程需要宿主基因突變的累積共同發(fā)揮作用，不同的HPV基因型致癌過程中所需的體細胞突變負荷和類型可能存在差異，迄今，TCGA已經(jīng)鑒定了宮頸癌的14個顯著突變基因，分別是SHKBP1、ERBB3、CASP8、HLA-A、TGFBR2、PIK3CA、EP300、FBXW7、HLA-B、PTEN、NFE2L2、ARID1A、KRAS和MAPK1，其中，HLA-A、HLA-B、NFE2L2、MAPK1、CASP8、SHKBP1和TGFBR2的突變僅在宮頸鱗癌中發(fā)現(xiàn)[6]。

3.宮頸癌的表觀遺傳修飾和miRNA表達水平的變化：表觀遺傳修飾是宮頸癌的一個重要特征，HPV和宿主基因的甲基化通過影響病毒基因的復制、細胞周期的調(diào)控、細胞凋亡和DNA修復等途徑促進腫瘤的發(fā)生。HPV基因組中的LCR是E2結(jié)合位點，具有潛在甲基化的CpG位點，其甲基化導致E2功能的抑制，使游離狀態(tài)下的E6、E7過表達[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，HPV16 LCR的CpG甲基化隨著宮頸新生血管的增多而增加[21]。宿主細胞中的凋亡基因DcR1和DcR2在侵襲性癌癥中高度甲基化[22]。甲基化在侵襲性宮頸癌和CINIII中比在CINI～II中更常見。此外，HPV和宿主基因的甲基化可能受HPV整合和基因型的影響。

miRNA是非轉(zhuǎn)錄RNA，通過誘導細胞增殖、凋亡和基因組不穩(wěn)定在宮頸癌變過程中發(fā)揮作用[23]。HPV癌蛋白及基因整合可以調(diào)節(jié)miRNA的表達水平，從而在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用，例如：E6癌蛋白降解p53，導致由p53調(diào)節(jié)的所有miRNA(miR-23b、miR-34a和miR-218等)的表達下調(diào)，E7通過E2F1失活誘導miR-15/16的過表達，導致c-myc或c-myb的下調(diào)[24-25]。miRNA在正常宮頸組織和宮頸病變組織中的表達水平差異較顯著，故其可能作為宮頸癌診斷和預后的生物標志物，但需更多的研究才能在臨床應用中進行驗證。

4.HPV介導的APOBEC突變：HR-HPV癌蛋白E6和E7的另一個目標是載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3(APOBEC3)，有研究表明，由于宿主對HPV感染的免疫反應引發(fā)的載脂蛋白B mRNA編輯催化多肽(APOBEC)突變是HPV陽性腫瘤主要的突變來源[6,11]。APOBEC3是一種胞嘧啶脫氨酶蛋白，APOBEC3家族由七種不同的蛋白質(zhì)組成，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其成員APOBEC3A和APOBEC3B受E6和E7的調(diào)節(jié)在HPV陽性癌癥中高表達[26-27]。機制之一是，HPV16 E6通過p53的降解上調(diào)TEAD1/4，導致APOBEC3B的轉(zhuǎn)錄增加[28]。第二種機制是HPV16 E7通過APOBEC3A上的Cullin-2結(jié)合基序與APOBEC3A結(jié)合，該復合物的形成阻止了APOBEC3A的降解，但APOBEC3A酶的活性不變[29]。APOBEC3A/B酶的作用機制為在TCW(T：胸腺嘧啶，C：胞嘧啶，W：腺嘌呤或胸腺嘧啶)基序中使胞嘧啶脫氨基突變?yōu)樾叵汆奏せ蝤B嘌呤(G)，即：TCW→TTW和TCW→TGW突變，統(tǒng)稱為“TCW”突變[29-30]。APOBEC3A在病毒感染宿主細胞時通過結(jié)合并編輯病毒DNA限制病毒感染，但APOBEC3B在細胞核中表達，在DNA修復過程中，APOBEC3B介導的胞嘧啶脫氨作用可能參與HPV致癌過程。TCGA報告了228例原發(fā)宮頸癌的廣泛分子特征，觀察到其中192例HPV相關(guān)宮頸癌中150例富含APOBEC突變[6]。

六、結(jié)語

綜上所述，HR-HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要原因，HPV病毒不同變異體的致癌潛能不同，對HPV變異體的研究有助于從核苷酸水平或分子水平了解HPV致宮頸癌變的機制。HR-HPV感染宿主細胞后通過其免疫逃避機制逃脫機體的免疫反應，病毒基因組通過宿主細胞的DNA損傷點整合入宿主基因組，整合導致E2癌基因被破壞而E6、E7過表達，過表達的E6、E7癌蛋白通過激活致癌基因、抑制抑癌基因、干擾有絲分裂、調(diào)節(jié)miRNA的表達量以及增加宿主細胞體細胞的突變等途徑導致宮頸癌的發(fā)生。研究表明，病毒基因的整合可能是LSIL向HSIL進展的早期事件，且miRNA在正常宮頸組織和宮頸病變組織中的表達水平差異較顯著，故對其的進一步研究可能為宮頸癌惡性程度的早期判斷及預后提供較為準確的生物學指標。雖有研究提出由HPV介導的APOBEC突變可能系HPV相關(guān)腫瘤的主要突變來源，但目前證據(jù)不足，需要進一步的研究來確定兩者是否相關(guān)。