王繼升，李海松，代恒恒，鄧 省，鮑丙豪，馮雋龍，王 彬

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，北京100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院男科，北京100700）

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是由于腦的供血?jiǎng)用}狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死的總稱，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)稱之為中風(fēng)［1］。勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是指男性性欲正常，受到有效刺激，而陰莖不能勃起或硬度不足以插入陰道，或勃起不能持續(xù)足夠時(shí)間，來(lái)維持正常性交的病癥，且超過(guò)3個(gè)月［2］。流調(diào)發(fā)現(xiàn)，在男性IS患者性功能障礙中，約有48%～75%出現(xiàn)ED［3］，且卒中后性欲減退的發(fā)生率約為17%～42%［4］。有文獻(xiàn)報(bào)道，勃起功能障礙可以作為腦卒中前期的危險(xiǎn)信號(hào)［5］。ED作為一種受廣泛研究和關(guān)注的男科疾病，病因復(fù)雜，除了受多種因素影響，還與其他多系統(tǒng)疾病密切關(guān)聯(lián)，如高脂血癥（hyperlipoidemia，HLP）等代謝性疾病皆是ED發(fā)生的重要風(fēng)險(xiǎn)因素［6，7］。美國(guó)一項(xiàng)調(diào)查顯示高脂血癥患者在所有ED患者中的比例約為41.8%，我國(guó)調(diào)查的比例更高，約為47%［8］。因此，IS合并HLP與ED可能在某些方面存在著一定的關(guān)聯(lián)性。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)其關(guān)聯(lián)性進(jìn)行研究并探討其相互作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 倫理批準(zhǔn)

實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7周齡SPF成年雄性SD大鼠30只，體重（200±20）g，購(gòu)于北京維通利華公司。大鼠在22～24℃恒溫條件的清潔環(huán)境下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前，所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.3 HLP模型建立及分組

將大鼠分成正常組（C組，n=10）和HLP組（n=20）兩組。正常組以正常飲食喂養(yǎng)，HLP組以高脂肪飲食喂養(yǎng)（2%膽固醇，12%蛋黃粉，8%豬油，0.5%膽酸鈉，77.5%基本飲食）。喂養(yǎng)10周后，從尾靜脈采血并測(cè)試血脂。將HLP組大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（S組，n=10）和模型組（M組，n=10）。模型組將HLP組中造模成功的大鼠用手術(shù)方式誘導(dǎo)其血栓形成。假手術(shù)組10只大鼠在僅僅暴露手術(shù)切口處理的情況下進(jìn)行相同的操作。

1.4 行為學(xué)觀察

完成腦缺血模型的術(shù)后24 h做神經(jīng)功能評(píng)分，每組隨機(jī)選取6只大鼠以觀察大鼠的神經(jīng)行為學(xué)，采用改良后的Bederson評(píng)分法［9］，總得分最低為0分，表示完全正常，無(wú)神經(jīng)功能缺陷（正常）；1分，抬起尾巴時(shí)無(wú)法伸展對(duì)側(cè)前爪（輕微）；2分，向健側(cè)轉(zhuǎn)圈（中度）；3分，不能向健側(cè)運(yùn)動(dòng)（重度）；4分，不能自主運(yùn)動(dòng)，意識(shí)水平低下（極重度）。得分≥1，即具有神經(jīng)系統(tǒng)缺陷癥狀。除正常組外，每組均在造模成功后24 h時(shí)進(jìn)行神經(jīng)損害程度評(píng)分，神經(jīng)功能缺損評(píng)分2～3分者入選。

1.5 ELISA檢測(cè)

每組選取6只大鼠檢測(cè)血清中cGMP、T、D-D的表達(dá)，根據(jù)說(shuō)明，使用ELISA試劑盒，用STATFAX 2100微孔板分光光度計(jì)在570 nm處檢測(cè)吸光度。

1.6 HE染色

從每只大鼠取出陰莖組織，每只選取陰莖部位相同，冷鹽水洗滌，并用4%多聚甲醛固定24 h。脫水后，石蠟包埋，4～5μm切片，蘇木精和伊紅（HE）染色。在顯微鏡下觀察HE染色的載玻片。

1.7 Western blot檢測(cè)

為檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)，大鼠取海綿體組織的一部分，在冰冷的組織裂解緩沖液中勻漿。將混合物離心10 min，之后收集上清液。用RIPA調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度并煮沸5 min。每個(gè)樣品用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。以β-actin作為內(nèi)參蛋白進(jìn)行免疫印跡，樣品在4℃條件下過(guò)夜。使用ECL檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)免疫反應(yīng)信號(hào)，并進(jìn)行讀取分析。

1.8 Real-time PCR檢測(cè)

通過(guò)對(duì)大鼠陰莖海綿體細(xì)胞總RNA的提取，并檢測(cè)其完整性，隨后經(jīng)分光光度計(jì)校驗(yàn)所提取RNA的純度以用于后續(xù)檢測(cè)。RNA逆轉(zhuǎn)錄后以25μL反應(yīng)體系進(jìn)行體外PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參照。95℃預(yù)變性5 min后進(jìn)行下列循環(huán)：94℃變性1 min；不同溫度下退火40 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；最后72℃充分延伸l0 min。反應(yīng)在熒光定量PCR儀中進(jìn)行，所有樣本均設(shè)3個(gè)平行孔重復(fù)，并記錄循環(huán)數(shù)（Ct值），通過(guò)相對(duì)定量（RQ）法比較基因的表達(dá)差異。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)（ANOVA）。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺血性腦卒中模型檢驗(yàn)

M組大鼠在術(shù)后24 h后狀態(tài)較差，四肢蜷縮，攝食量減少、體重有所下降等；同時(shí)出現(xiàn)不同程度的右側(cè)前肢屈曲，甚至出現(xiàn)原地轉(zhuǎn)圈現(xiàn)象，而C組和S組表現(xiàn)正常，說(shuō)明腦缺血模型造模成功。

2.2 血清T、D-D水平

通過(guò)ELISA方法檢測(cè)大鼠血清T、D-D表達(dá)，結(jié)果顯示：與C組比較，S組血清T和D-D的表達(dá)無(wú)差異（P＞0.05），M組血清T的表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）、D-D表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 各組血清T、D-D的表達(dá)（n=6，±s）Tab 1 ELISA method to detect the expression of T and D-D in serum（n=6，±s）

表1 各組血清T、D-D的表達(dá)（n=6，±s）Tab 1 ELISA method to detect the expression of T and D-D in serum（n=6，±s）

注：與C組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

D-D（μg/L）55.70±9.72 62.70±13.88 84.39±16.46**7.217 0.006組別C組S組M組FP T（ng/m L）0.76±0.37 0.62±0.39 0.25±0.04*4.162 0.036

2.3 陰莖組織中的cGMP水平

通過(guò)ELISA方法檢測(cè)陰莖海綿體組織中cGMP表達(dá)含量，結(jié)果顯示：與C組比較，S組大鼠的陰莖組織中cGMP的表達(dá)未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。M組大鼠陰莖組織中的cGMP含量的表達(dá)明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.4 陰莖海綿體組織HE染色

HE染色結(jié)果顯示，C組與S組大鼠海綿狀小梁分布均勻，血竇豐富，間質(zhì)組織未見(jiàn)增生。與正常組比較，M組大鼠的海綿狀小梁排列順序雜亂無(wú)章，血竇明含量顯少于正常組大鼠。此外，模型組大鼠陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞密度呈現(xiàn)明顯降低趨勢(shì)，見(jiàn)圖1。

表2 各組陰莖組織中c GMP的表達(dá)（n=6，±s）Tab 2 ELISA method to detect the expression of c GMP in penile tissue（n=6，±s）

表2 各組陰莖組織中c GMP的表達(dá)（n=6，±s）Tab 2 ELISA method to detect the expression of c GMP in penile tissue（n=6，±s）

注：與C組比較，*P＜0.05。

cGMP（ng/gL）0.92±0.2 0.76±0.17 0.56±0.25*4.317 0.033組別C組S組M組FP

2.5 Western blot結(jié)果

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：與C組比較，S組中VEGF蛋白表達(dá)具有顯著差異，其表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。與S組比較，M組VEGF蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表3和圖2。

表3 各組陰莖海綿體中VEGF蛋白的表達(dá)（n=6，±s）Tab 3 Expression of VEGF protein in the corpus cavernosum of the penis（n=6，±s）

表3 各組陰莖海綿體中VEGF蛋白的表達(dá)（n=6，±s）Tab 3 Expression of VEGF protein in the corpus cavernosum of the penis（n=6，±s）

注：與C組比較，*P＜0.05；與S組比較，##P＜0.01。

VEGF 0.98±0.17 1.24±0.21*1.67±0.15##22.021＜0.001組別C組S組M組F P

2.6 Real-time PCR結(jié)果

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與C組比較，S組中VEGF mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）。與S組比較，M組中VEGF mRNA表達(dá)升高（P＜0.01），見(jiàn)表4。

圖1 HE染色結(jié)果Fig 1 HE staining results

圖2 WB檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)Fig 2 WB detects the expression of VEGF protein

表4 各組陰莖海綿體中VEGF m RNA的表達(dá)（n=6，±s）Tab 4 Expression of VEGF m RNA in the cavernous body of the penis（n=6，±s）

表4 各組陰莖海綿體中VEGF m RNA的表達(dá)（n=6，±s）Tab 4 Expression of VEGF m RNA in the cavernous body of the penis（n=6，±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，##P＜0.01。

VEGF 1 1.62±0.17*3.43±0.63##67.022＜0.001組別C組S組M組F P

3 討論

本研究表明，HLP可致使陰莖海綿體組織結(jié)構(gòu)改變，即平滑肌細(xì)胞成分減少，膠原增加和細(xì)胞器損傷等，這些變化可能是引起ED的重要原因之一［10，11］。HLP可以導(dǎo)致ED，其機(jī)制可能與VEGF、硫化氫合酶的活性的顯著降低有關(guān)［12］。高脂血癥可引起脂肪堆積，使T轉(zhuǎn)化成E2的關(guān)鍵酶P450表達(dá)明顯增強(qiáng)；高E2負(fù)反饋抑制HPT軸功能，T分泌降低，這又促進(jìn)脂肪 生 成 增 多［13，14］。

IS合并HLP可以共同誘導(dǎo)勃起功能下降。本研究發(fā)現(xiàn)這種聯(lián)合作用是通過(guò)抑制VEGF、cGMP和T等表達(dá)，以及增強(qiáng)了D-D的表達(dá)，從而造成勃起功能下降。VEGF可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)進(jìn)而改善內(nèi)皮功能、增加平滑肌的數(shù)量從而改善ED大鼠的勃起功能［15］，VEGF又可通過(guò)促使腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞增殖和血管新生從而改善腦卒中相關(guān)并發(fā)癥［16］。環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷的作用機(jī)制目前較明確，環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷為細(xì)胞內(nèi)第二信使分子，是勃起功能產(chǎn)生的重要物質(zhì)之一，其作用機(jī)制為直接作用于陰莖海綿體靶點(diǎn)，通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)外濃度，調(diào)控鈣離子內(nèi)流外流平衡機(jī)制，從而起到調(diào)節(jié)陰莖勃起的機(jī)制［17］。同時(shí)cGMP參與中樞神經(jīng)生理效應(yīng)產(chǎn)生過(guò)程，可抑制血小板聚集，避免血栓形成［18］，這種協(xié)同作用導(dǎo)致ED的發(fā)生。

D二聚體作為臨床常用指標(biāo)，代謝機(jī)制為血漿纖維蛋白原交聯(lián)后經(jīng)纖溶酶水解產(chǎn)生的特異性降解產(chǎn)物。在臨床中D二聚體常作為凝血和纖溶系統(tǒng)的異常的指標(biāo)之一，具有特異性。研究表明若其水平持續(xù)升高，則相對(duì)體現(xiàn)血栓危險(xiǎn)性增加。此外，D二聚體作為特異性分子標(biāo)志物，其表達(dá)異常會(huì)增加ED和IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［19］。

動(dòng)脈斑塊形成后，往往最先阻礙較細(xì)的動(dòng)脈血流，當(dāng)海綿體動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化阻礙血液灌注造成ED時(shí)，由于腦動(dòng)脈相比陰莖海綿體動(dòng)脈較大，很可能處在代償期。即使腦動(dòng)脈尚未出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀及表現(xiàn)，但仍有一定潛在風(fēng)險(xiǎn)，即臨床中常見(jiàn)的心腦血管疾病的隱匿期［20，21］。臨床發(fā)現(xiàn)，以ED為主訴的中老年患者往往同時(shí)存在誘發(fā)腦血管疾病的高危因素，如三高、吸煙、低通氣睡眠呼吸暫停綜合征等。在追溯許多腦血管疾病患者的既往病史時(shí)發(fā)現(xiàn)，許多患者在這類疾病發(fā)生前的一段時(shí)間內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)了ED表現(xiàn)；并在疾病發(fā)生后伴有ED加重的趨勢(shì)［22］。許多伴有ED的腦卒中患者，在相關(guān)?？七M(jìn)行一段時(shí)間的治療后，勃起功能會(huì)隨之改善。本研究為初步探索兩者之間相關(guān)性，研究尚未深入，后續(xù)研究將深入探索這種相關(guān)性背后的具體機(jī)制，從而拓展勃起功能障礙的診療的思路。

本研究仍存在諸多局限性，在今后的研究中，可以擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證缺血性腦卒中合并高脂血癥與勃起功能之間的關(guān)系，分析IS合并HLP與ED之間的相關(guān)通路聯(lián)系，并結(jié)合通路抑制劑和激活劑等進(jìn)行驗(yàn)證。