侯 杰，周欣欣，張俊清，2，賴偉勇，2

（1.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?71199；2.海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?71199；3.哈爾濱工商大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150076）

裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook.ex Arn.）是馬鞭草科紫珠屬植物，主要分布于我國廣東、廣西和海南等地。現(xiàn)代藥理活性研究表明裸花紫珠中黃酮類和三萜及其苷類、苯丙素苷和環(huán)烯醚萜苷為其主要成分［1］。裸花紫珠具有止血、抗炎、抑菌、增強(qiáng)免疫、細(xì)胞毒等作用［2-5］。裸花紫珠的止血抗炎功效被得到了廣泛研究，利用裸花紫珠研制止血膏劑、噴霧劑等［4，6］，并對不同止血?jiǎng)┬瓦M(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。本研究從裸花紫珠散劑的鑒別（薄層色譜）、重金屬及有害元素限量檢查、主要有效成分含量檢測（高效液相色譜）等方面較系統(tǒng)研究質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為裸花紫珠散劑的進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裸花紫珠散劑（課題組制備），甲醇、乙酸乙酯、三氯化鋁、乙醇、鹽酸、硫脲、抗壞血酸、高氯酸、硝酸、鐵氰化鉀均為分析純，甲酸、乙腈為色譜純。木犀草苷對照品、毛蕊花糖苷對照品；砷（As）、鉛（Pb）、汞（Hg）、鎘（Cd）、銅（Cu）元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；砷、鉛、汞、鎘、銅元素?zé)簟?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

原子吸收光譜儀（ICE3000賽默飛美國）、原子熒光光譜儀（AFS-830北京）、高效液相色譜儀（waterse2695美國）

1.3 方法

1.3.1 裸花紫珠散劑薄層鑒別項(xiàng)的建立 供試品溶液的制備：取三批裸花紫珠散劑各1 g，分別放入25 mL容量瓶中，加甲醇定容至25 mL，超聲30 min。放冷，用甲醇補(bǔ)足。搖勻，濾過，取濾液，即得。

對照品溶液的制備：精密稱取木犀草苷對照品，加甲醇配置成0.2 mg/mL的木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為木犀草苷對照品溶液。精密稱取毛蕊花糖苷對照品，加甲醇配置成1.0 mg/mL的毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為毛蕊花糖苷對照品溶液。

薄層鑒別方法：取上述方法制備對照品溶液和供試品溶液，分別點(diǎn)于同一0.5%NaOH硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯∶甲酸∶水（28∶2∶3）為展開劑，展開，取出晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，105℃加熱5 min，于紫外光（365 nm）下檢視。

專屬性實(shí)驗(yàn)：取3批裸花紫珠散劑供試品溶液、對照品溶液，空白溶液（甲醇），按照上述方法做薄層鑒別實(shí)驗(yàn)兩次，記錄薄層色譜圖。

重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)：取3批裸花紫珠散劑供試品溶液、對照品溶液，由兩名實(shí)驗(yàn)人員照A和B按照上述方法做薄層鑒別實(shí)驗(yàn)，記錄薄層色譜圖。

耐用性實(shí)驗(yàn)：取3批裸花紫珠散劑供試品溶液、對照品溶液，按照上述方法但使用兩批不同批次的薄層色譜板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄薄層色譜圖

薄層鑒別項(xiàng)檢驗(yàn)：分別吸供試品溶液、對照品3種溶液各10～20μL，依次點(diǎn)于同一薄層色譜板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄薄層色譜圖。

1.3.2 重金屬及有害元素檢查項(xiàng)的建立 對照品溶液的制備：取砷、鉛、汞、鎘、銅元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別于100 mL容量瓶中制得到各含元素1、1、0.1、0.1、100μg/mL的母液。測定砷含量時(shí)取母液0.0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL，分別加入5 mL鹽酸、2%硫脲與1%抗壞血酸后加純水定容至100 mL；測定鉛含量時(shí)取母液0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，分別加入1.5 mL鹽酸后加純水至100 mL；測定汞含量時(shí)取母液0.0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL，分別加入5 mL鹽酸后加純水至100 mL；測定鎘、銅含量時(shí)取母液0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，分別加入1.5 mL鹽酸后加純水定容至100 mL。即得各元素的對照品溶液。

供試品溶液的制備：3批次裸花紫珠散劑各取1 g，分別加10 mL純水、1.5 mL高氯酸、15 mL硝酸后置于電熱板上消化。消化后測定砷含量時(shí)加2.5 mL鹽酸、2%硫脲和1%抗壞血酸后加純水定容至50 mL，測定鉛含量時(shí)加1.5 mL硝酸后加純水定容至50 mL，測定汞含量時(shí)加2.5 mL鹽酸后加純水定容至50 mL、測定鎘含量時(shí)加1.5 mL鹽酸后加純水定容至50 mL、測定銅含量時(shí)加1.5 mL鹽酸后純水定容至50 mL。即得各元素的供試品溶液。

儀器參數(shù)設(shè)置：砷：原子熒光光譜儀，5%鹽酸載流，還原溶液為2%硼氫化鉀與0.4%KOH，負(fù)高壓290 V，燈電流75 mA；鉛：原子熒光光譜儀，1.5%硝酸與0.2%鐵氰化鉀載流，還原溶液為1%硼氫化鉀與0.2%KOH，負(fù)高壓270 V，燈電流65 mA；汞：原子熒光光譜儀，5%鹽酸載流，還原溶液為0.5%硼氫化鉀與0.1%KOH，負(fù)高壓270 V，燈電流75 mA；鎘：原子熒光光譜儀，5%鹽酸與2%硫脲載流，還原溶液為2%硼氫化鉀與0.4%KOH，負(fù)高壓270 V，燈電流60 mA；銅：原子吸收光譜儀，測定波長為324.7，燈電流8 mA，火焰類型Air-C2H2。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：配制5種重金屬元素不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行檢測，建立5種重金屬的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度試驗(yàn)：隨機(jī)抽取一瓶供試品溶液，重復(fù)測定6次，計(jì)算砷、鉛、汞、鎘、銅元素的平均值。

回收率試驗(yàn)：取已知重金屬及有害元素離子含量的樣品，分別精密加入高、中、低3個(gè)濃度的各元素對照品溶液，按上述方法測定砷、鉛、汞、鎘、銅元素加標(biāo)回收率。

樣品中重金屬及有害元素含量測定：采用上述建立的方法，對3批裸花紫珠散劑樣品中5種重金屬及有害元素進(jìn)行檢測。

1.3.3 高效液相色譜法含量測定方法的建立 色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.1%甲酸溶液-乙腈（85∶15）為流動(dòng)相，選擇雙波長檢測，木犀草苷檢測波長為350 nm，毛蕊花糖苷檢測波長為330 nm；柱溫為35℃；流速1.0 mL/min。

供試品溶液的制備：取三批裸花紫珠散劑，各1 g，分別放入具塞錐形瓶中，加70%甲醇50 mL，超聲40 min。放冷，用甲醇補(bǔ)足。搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

對照品溶液的制備：精密稱取木犀草苷、毛蕊花糖苷對照品，加70%甲醇配置成每1 mL含木犀草苷20 mg、毛蕊花糖苷250 mg的混合對照品溶液，即得。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以進(jìn)樣體積為橫坐標(biāo)（X），以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸數(shù)據(jù)處理，計(jì)算出木犀草苷和毛蕊花糖苷的線性回歸方程。

含量測定：采用含量測定的方法，取3批裸花紫珠局部用散劑進(jìn)行含量測定。

2 結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別項(xiàng)建立結(jié)果

2.1.1 專屬性、重現(xiàn)性和耐用性試驗(yàn)結(jié)果 專屬性試驗(yàn)薄層色譜圖中對照品與供試品在相同位置上有相同顏色的熒光點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰可見，兩種成分分離度較好，見圖1。陰性對照溶液無熒光斑點(diǎn)，說明該方法專屬性良好。重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，兩名實(shí)驗(yàn)員得到的薄層色譜圖基本一致，兩份色譜圖中對照品與供試品在相同位置上有相同顏色的熒光點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰可見，兩種成分分離度較好，說明該方法重現(xiàn)性良好。耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，不同批次薄層板得到的薄層色譜圖基本一致，對照品與供試品在相同位置上有相同顏色的熒光點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰可見，兩種成分分離度較好，說明該方法耐用性良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)結(jié)果Fig 1 Specific r esults

圖2 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Fig 2 Reproducibility results

圖3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Fig 3 Serviceability results

2.1.2 薄層色譜鑒別項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果 3批裸花紫珠散劑供試液在薄層色譜圖上與木犀草苷、毛蕊花糖苷對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。該方法熒光斑點(diǎn)清晰可見，兩種成分分離度較好，該薄層色譜鑒別項(xiàng)簡單可行。見圖4。

2.2 重金屬及有害元素檢查項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果

圖4 裸花紫珠散劑薄層檢驗(yàn)結(jié)果Fig 4 TLC results of callicarpa nudiflora powder

2.2.1 重金屬及有害元素標(biāo)準(zhǔn)曲線 以元素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度或者熒光值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到5種重金屬及有害元素標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。由表可知，5種重金屬及有害元素的相關(guān)系數(shù)均在0.996以上，表明5種元素線性關(guān)系良好。

表1 重金屬及有害元素標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab 1 Standard curve of heavy metals and harmful elements

2.2.2 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果 隨機(jī)抽取一瓶供試品溶液，重復(fù)測定6次，砷、鉛、汞、鎘、銅元素平均值分別為2.918、10.015、0.631、0.297、0.044 7（μg/kg），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.35%、0.13%、2.97%、1.26%、0.82%，表明該方法精密度良好。見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（μg/kg）Tab 2 Precision results（μg/kg）

砷、鉛、汞、鎘、銅元素加標(biāo)回收率平均值分別為96.1%、95.8%、95.4%、98.8%、98.8%，表明該方法能準(zhǔn)確測定待測樣品中的5種重金屬含量及有害元素。見表3。

表3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Recovery results

2.2.3 重金屬及有害元素含量測定試驗(yàn)結(jié)果 重金屬及有害元素含量測定結(jié)果見表4，3批裸花紫珠散劑中示砷含量平均值為2.745μg/kg、鉛含量平均值為10.413μg/kg、汞含量平均值為0.860μg/kg、鎘含量平均值為0.252μg/kg、銅含量平均值為0.046 7 μg/kg。以上重金屬及有害元素含量遠(yuǎn)低于《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的綠色藥材重金屬限量要求，表明本品重金屬及有害元素含量符合要求。

表4 3批散劑的重金屬含量（μg/kg）Tab 4 Content of heavy metals in three batches of callicarpanudiflora powder（μg/kg）

2.3 含量檢測項(xiàng)建立試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以進(jìn)樣體積為橫坐標(biāo)（X），以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸數(shù)據(jù)處理，所得到的木犀草苷的線性回歸方 程 為：Y=53 342X-36 343，r=1.000 0；毛蕊花糖苷的線性回歸方程為：Y=379 198X-152 266，r=0.999 9。見圖5。

圖5 木犀草苷和毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 5 Standard curve

2.3.2 含量測定結(jié)果 毛蕊花糖苷和木犀草苷的液相色譜圖可見圖6、7，檢測波長330 nm保留時(shí)間為23 min處的峰為毛蕊花糖苷，檢測波長350 nm保留時(shí)間21 min處峰為木犀草苷。對3批裸花紫珠散劑進(jìn)行木犀草苷和毛蕊花糖苷含量測定，木犀草苷和毛蕊花糖苷的平均含量分別為0.614 7和7.282 2 mg/g，以平均含量的80%為下限，規(guī)定裸花紫珠散劑中木犀草苷含量應(yīng)不低于0.48%，毛蕊花糖苷含量應(yīng)不低于5.83%，見表5。

圖6 毛蕊花糖苷的色譜圖Fig 6 HPLC of mullein glycoside

圖7 木犀草苷的色譜圖Fig 7 HPLC of luteolin

表5 裸花紫珠散劑含量測定結(jié)果Tab 5 Content determination results of callicarpa nudiflora powder

3 討論

本研究建立了裸花紫珠散劑的薄層色譜鑒定法，對此方法用于裸花紫珠散劑鑒定的專屬性、重復(fù)性、耐用性進(jìn)行了考察。該方法熒光斑點(diǎn)清晰可見，兩種主要成分木犀草苷和毛蕊花糖苷成分分離度較好專屬性、重現(xiàn)性、耐用性效果良好，同時(shí)基于該薄層色譜法建立了裸花紫珠散劑的薄層鑒別項(xiàng)。

利用火焰原子吸收法和氫化物原子熒光法，建立了裸花紫珠散劑鉛、鎘、砷、汞、銅5種重金屬及有害元素的測定方法，砷、鉛、汞、鎘、銅5種重金屬元素的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.999 1、0.999 1、0.999 8，0.996 4、0.999 6，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.35%、0.13%、2.97%、1.26%、0.82%，回收率平均值分別為96.1%、95.8%、95.4%、98.8%、98.8%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定。裸花紫珠散劑中砷含量平均值為2.745μg/kg、鉛含量平均值為10.413μg/kg、汞含量平均值為0.860μg/kg、鎘含量平均值為0.252μg/kg、銅含量平均值為0.046 7μg/kg。以上重金屬含量遠(yuǎn)低于《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的綠色藥材重金屬限量要求。同時(shí)，建立了裸花紫珠散劑鑒別的重金屬檢查項(xiàng)：按照檢測鉛、鎘、砷、汞、銅含量方法測定，鉛不超過5 mg/kg，鎘不超過0.3 mg/kg，砷不超過2 mg/kg，汞不超過0.2 mg/kg，銅不超過20 mg/kg。

采用高效液相色譜法測定裸花紫珠中主要有效成分木犀草苷和毛蕊花糖苷的含量，木犀草苷的線性回歸方程為：Y=53 342X-36 343，線性相關(guān)系數(shù)為1；毛蕊花糖苷的線性回歸方程為：Y=379 198X-152 266，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9。含量測定結(jié)果，木犀草苷平均值為0.061 47 mg/g、毛蕊花糖苷平均值為7.282 2 mg/g。以平均含量的80%為下限，建立了裸花紫珠散劑含量測定項(xiàng)，規(guī)定裸花紫珠散劑中木犀草苷含量應(yīng)不低于0.48%，毛蕊花糖苷含量應(yīng)不低于5.83%。

綜上所述，本研究所建立的黎藥裸花紫珠散劑質(zhì)量控制方法簡單，專屬性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性好，可用于裸花紫珠散劑的質(zhì)量控制。