張 君，詹 峰，孫 娟，丁毅鵬

（1.海南醫(yī)學院附屬海南醫(yī)院，2.海南省人民醫(yī)院急診科，3.海南省人民醫(yī)院全科醫(yī)學科，海南 ?？?70311）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種常見的氣道疾病，其特征是慢性毛細支氣管炎和肺氣腫［1］，研究表明，COPD由遺傳和環(huán)境危險因素相互作用引發(fā)的肺部炎癥所誘發(fā)［2］。預計到2020年成為全球慢性發(fā)病與死亡的第3大誘因［3］。研究表明，COPD與嚴重的新型冠狀病毒（COVID-19）相關(guān)，COPD合并COVID-19患者致死率更高［4］。

環(huán)狀RNA（circRNA）是一類非編碼RNA［5］，與傳統(tǒng)的線性RNA相比，它的分子結(jié)構(gòu)呈閉合環(huán)狀，不含有3′-ployA尾和5′-帽子結(jié)構(gòu)，不易被核酸外切酶降解，比線性RNA更穩(wěn)定，種類繁多，廣泛分布于不同的組織與結(jié)構(gòu)中，數(shù)量為線性mRNA的10倍［6，7］。環(huán)狀RNA主要通過競爭性結(jié)合miRNA，實現(xiàn)對miRNA靶基因的調(diào)控［8］，也可以通過直接調(diào)控基因表達發(fā)揮功能［9］。在COPD［10］、心肌梗死［11］、腫瘤［12］等中發(fā)揮重要功能。研究表明，CircRNA 0001859可以作為COPD和急性COPD的新診斷和預后生物標志物［13］。COPD相關(guān)環(huán)狀RNA表達網(wǎng)絡(luò)與可能調(diào)控機制的研究目前尚不太了解。

本研究，通過收集5例COPD患者與5名正常人的外周血單個核細胞，進行環(huán)狀RNA轉(zhuǎn)錄組測序，檢測并分析COPD外周血單個核細胞環(huán)狀類型，環(huán)狀RNA差異表達，環(huán)狀RNA來源基因的GO（Gene Ontology，基因本體論）功能聚類與環(huán)狀RNA來源基因的KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書）信號通路聚類分析。為從環(huán)狀RNA角度進一步闡述COPD發(fā)病機制與環(huán)狀RNA在COPD中可能的調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 測序樣本收集

采用紫色抗凝管采集5例50歲左右男性COPD患者和5名50歲左右男性的正常人的外周血。COPD患者來自海南省人民醫(yī)院急診科，經(jīng)2名以上醫(yī)師根據(jù)COPD指南診斷為COPD，正常對照來著海南省人民醫(yī)院體檢中心。全血加入等量體積的PBS混合后加入淋巴細胞分離液（購自上海愛必信生物科技有限公司），充分混合后3 000g離心30 min，移液槍分離出白細胞層并采用PBS漂洗，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取

根據(jù)說明書要求，使用Trizol試劑盒（購自美國Invitrogen公司）提取總RNA。在Agilent 2100生物分析儀（購自美國Agilent Technologies公司）上評估RNA質(zhì)量。提取后，將總RNA用RNase R處理以降解線性RNA，并使用RNeasy MinElute Cleanup Kit（購自荷蘭Qiagen公司）進行純化。

1.3 建庫測序

使用用于Illumina的VAHTS總RNAseq（H/M/R）文庫制備試劑盒（購自中國南京Vazyme公司）構(gòu)建了特異性鏈文庫。簡要地說，除去核糖體RNA以保留環(huán)狀RNA。隨后將富集的環(huán)狀RNA打斷并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并合成反義鏈，得到雙鏈cDNA。接下來，用VAHTSTM DNA Clean Beads（購自中國南京Vazyme公司）純化cDNA片段，進行末端修復，添加poly（A），并連接至Illumina測序接頭。采用尿嘧啶-N-糖基化酶將另外一鏈化解。使用VAHTSTM DNA Clean Beads純化，PCR擴增，并使用Illumina HiSeqTM 2500進行測序。

1.4 環(huán)狀RNA鑒定與差異分析

將測序得到序列與參考基因組比對，以發(fā)現(xiàn)剪接位點內(nèi)的獨特錨定位置。以相反方向（從頭到尾）排列的錨定指示環(huán)狀RNA剪接，然后進行find_circ分析［14］以鑒定環(huán)狀RNA，并根據(jù)GU/AG剪接位點擴展兩側(cè)序列。如果至少在一個樣品中至少有兩個獨特的反向剪接讀數(shù)支持，則稱為候選環(huán)狀RNA。為了鑒定COPD與正常組之間差異表達的環(huán)狀RNA，使用edgeR軟件包分析組間差異（http：//www.r-project.org/，3.12.1版本）。筆者鑒定出以變化倍數(shù)Foldchange絕對值≥2且P＜0.05評判為COPD與正常組間具有顯著差異的環(huán)狀RNA。

1.5 環(huán)狀RNA來源基因功能與信號通路分析

首先，將所有環(huán)狀RNA來源基因映射到GO數(shù)據(jù) 庫（http：//www.geneontology.org/）［15］中 的GO分類，計算富集P值并經(jīng)過FDR校正，以FDR≤0.05認為GO功能顯著富集。這項分析能夠識別出環(huán)狀RNA來源基因行使的主要生物學功能。KEGG是公共信號通路相關(guān)數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/）［16］。通路富集分析確定了環(huán)狀RNA來源基因中顯著富集的代謝途徑或信號轉(zhuǎn)導途徑以研究環(huán)狀RNA來源基因的主要功能與通路，富集計算得出的P值通過FDR校正，以q值（即FDR）≤0.05認為KEGG信號通路顯著富集。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)狀RNA鑒定與分類

共計鑒定出1 215個環(huán)狀RNA，其中根據(jù)環(huán)狀RNA在基因組上相對于蛋白編碼基因的位置，可將環(huán)狀RNA劃分為六類，其中多個外顯子環(huán)狀RNA（annot_exons）347個、內(nèi)含子間環(huán)狀RNA（intronic）16個、一個外顯子環(huán)狀RNA（one_exon）385個、外顯子與內(nèi)含子中間環(huán)狀RNA（exon_intron）52個、基因間環(huán)狀RNA（intergenic）257個、反義序列環(huán)狀RNA（antisense）158個。見圖1。

圖1 環(huán)狀RNA各分類數(shù)量統(tǒng)計Fig 1 Cir c RNA statistics of the number of categor ies

2.2 COPD顯著差異環(huán)狀RNA

COPD組相對正常對照組（Control），以變化倍數(shù)Foldchange絕對值≥2且P＜0.05認為具有顯著差異的環(huán)狀RNA共計187個，其中上調(diào)107個，下調(diào)80個，差異環(huán)狀RNA熱圖見圖2。COPD組中上調(diào)最顯著的前5個差異環(huán)狀RNA與COPD組中下調(diào)最顯著的前5個差異環(huán)狀RNA見表1。

圖2 COPD顯著差異環(huán)狀RNA熱圖Fig 2 Circular RNA heat map of significant difference in COPD

表1 COPD組差異最顯著的前5個環(huán)狀RNATab 1 Top 5 circ RNAs with the most significant difference in the COPD group

2.3 COPD差異環(huán)狀RNA來源基因GO功能分析

差異的環(huán)狀RNA，根據(jù)其來源的基因進行GO功能聚類，結(jié)果顯示，根據(jù)功能分類內(nèi)基因數(shù)量排序，在生物學過程（biological process）功能分類中變化最明顯的功能是細胞過程（cellular process），在細胞成分（cell component）功能分類中變化最明顯的功能是細胞（cell），在分子功能（molecular function）功能分類中變化最明顯的功能是結(jié)合（binding），見圖3?？梢姴町惖沫h(huán)狀RNA可能主要通過調(diào)控細胞結(jié)合的細胞過程相關(guān)功能基因影響COPD的疾病進展。

2.4 COPD差異環(huán)狀RNA來源基因KEGG信號通路分析

差異的環(huán)狀RNA，根據(jù)其來源的基因進行KEGG信號通路聚類，結(jié)果顯示，根據(jù)q值（即FDR值）進行排序，變化最明顯的前3個通路分別是：非同源末端連接通路（non-homologous end-joining）、鐵死亡通路（ferroptosis）與FoxO信號通路（FoxO signaling pathway），見圖4。

圖3 COPD差異環(huán)狀RNA來源基因GO功能聚類圖Fig 3 COPD differential cir cular RNA host gene GO function cluster map

圖4 COPD差異環(huán)狀RNA來源基因KEGG信號通路聚類圖Fig 4 COPD differential circular RNA host gene KEGG signal pathway cluster map

3 討論

目前已有許多COPD潛在的非編碼診斷分子，如mir-146a/b［17］、lncRNA SNHG5［18］以及環(huán)狀RNA CircRNA 0001859［19］。但是，目前均未進行臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。環(huán)狀RNA具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，良好的保守性，組織特異性以及至關(guān)重要的生物學功能，這些特性使環(huán)狀RNA分子可能成為COPD預后的優(yōu)良生物標志物［19］。本研究中，COPD與正常對照組中共計鑒定出1 215個環(huán)狀RNA，具有顯著差異的環(huán)狀RNA共計187個，其中上調(diào)107個，下調(diào)80個。提示，部分環(huán)狀RNA可能參與COPD發(fā)生發(fā)展，具有進一步驗證與深入探討的潛力。

環(huán)狀RNA表達的改變在各種病理狀況的發(fā)展中起著重要作用，研究表明，環(huán)狀RNA可以參與炎癥［20］、分化［21］、增殖侵襲［22］等功能?；诃h(huán)狀RNA可以通過來源基因［23］、ceRNA［24］、直接結(jié)合蛋白［25］等方式調(diào)控蛋白表達。筆者通過對COPD差異環(huán)狀RNA來源基因的GO富集分析，發(fā)現(xiàn)了COPD差異環(huán)狀RNA來源基因功能可能主要是通過調(diào)控細胞過程以及分子結(jié)合的功能，可能通過調(diào)控COPD關(guān)鍵基因表達參與的細胞過程影響COPD發(fā)生發(fā)展。筆者通過COPD差異環(huán)狀RNA來源基因的KEGG信號通路分析，發(fā)現(xiàn)了COPD差異環(huán)狀RNA來源基因影響的信號通路主要是非同源末端連接通路、鐵死亡通路與Fox O信號通路。非同源末端連接通路是DNA雙鏈斷裂后修復的途徑之一，參與調(diào)控細胞周期并影響增殖［26］，在腫瘤調(diào)控中具有重要功能［27］，而非同源末端連接通路可能導致肺氣腫中Ⅱ型肺泡細胞死亡［28］。鐵死亡通路是一種細胞新型死亡方式，主要通過鐵參與的抑制GPX4蛋白促進ROS激活后的脂質(zhì)過氧化引起的細胞死亡［29］。研究表明，鐵死亡參與了COPD的發(fā)病過程［30］。研究表明，NCOA 4介導的鐵蛋白吞噬作用與香煙煙霧引起的鐵死亡可以促進COPD發(fā)展［31］。香煙煙霧引起的上皮細胞鐵死亡也可以促進COPD的發(fā)生發(fā)展［32］。Fox O信號通路是Fox O轉(zhuǎn)錄因子家族的一個亞家族，在細胞命運決定中起著重要作用，該亞家族也被認為在多種癌癥中起著關(guān)鍵的抑癌作用［33］。研究表明，異常激活的EGFR通過調(diào)節(jié)核FoxO3A促進COPD氣道上皮細胞IL-8表達［34］。由此可見，環(huán)狀RNA調(diào)控的非同源末端連接通路、鐵死亡通路與FoxO信號通路可能參與COPD等肺部疾病調(diào)控，值得進一步探討。

本研究也存在一定不足：（1）應(yīng)該進一步擴大COPD與正常樣本，采用RT-PCR與FISH檢測驗證差異環(huán)狀RNA的表達變化；（2）構(gòu)建過表達與沉默載體轉(zhuǎn)染，進一步驗證環(huán)狀RNA的功能與調(diào)控機制；（3）根據(jù)數(shù)據(jù)庫預測與分子生物學實驗驗證環(huán)狀RNA的調(diào)控機制。這些將是筆者下一步驗證與探討的主要內(nèi)容。

本研究表明，COPD與正常組間存在差異環(huán)狀RNA，這些環(huán)狀RNA可能作為COPD的潛在檢測指標，或調(diào)控關(guān)鍵分子；且這些環(huán)狀RNA可能通過非同源末端連接通路、鐵死亡通路與FoxO信號通路調(diào)控影響COPD。為從環(huán)狀RNA這個新角度理解COPD的發(fā)病機制，以及環(huán)狀RNA作為COPD潛在的檢測與干預靶點提供理論依據(jù)。