武小利，高 紡，吳生兵，陳幸生

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥230012；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研中心，安徽 合肥230012；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腦病四科，安徽 合肥230061）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種慢性胃腸功能性疾病，患者人數(shù)占胃腸病患者的30%～50%，其主要表現(xiàn)為腹部脹痛、排便異常。我國人群總患病率達6.5%［1］，全球近1/5人群有IBS的臨床癥狀，IBS嚴(yán)重影響著人群健康［2］。便秘型腸易激綜合征（irritable bowel syndrome with constipation，IBS-C）是其亞型之一，其病因、發(fā)病機制復(fù)雜，各種原因引起的腸道敏感性和腸道動力異常均能導(dǎo)致發(fā)病。西醫(yī)依靠藥物治療IBS-C，但存在不良反應(yīng)大、且易復(fù)發(fā)的缺點。相比而言，中醫(yī)傳統(tǒng)療法有傷害性小、療效穩(wěn)定的特點，優(yōu)勢明顯；其中，電針可通過調(diào)節(jié)機體氣血、陰陽和臟腑起到治療腸易激綜合征的目的［3］。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)穴位間具有協(xié)同作用且針刺四單穴組方對改善IBS-C模型便秘癥狀的效果最佳［4］。研究表明CGRP和5-HT參與了中樞與胃腸互相作用過程［5］。CGRP在胃腸道廣泛分布，能調(diào)節(jié)胃腸分泌及運動［6］。5-HT是與腸道動力和敏感性密切相關(guān)的遞質(zhì)，與多種胃腸道疾病有關(guān)［7，8］。因此，本研究通過建立IBS-C大鼠模型，探討電針對IBS-C模型大鼠血清和結(jié)腸中降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）和五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

選取3個月齡SD大鼠50只，重量220～280 g，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（皖）2017-001。大鼠放置在獨立送風(fēng)隔離籠具中飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度（22±1）℃，相對濕度（55±5）%，自然光照，自取食水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)字表法，選取10只作為正常對照組，其余40只進行IBS-C模型的復(fù)制，模型復(fù)制過程中死亡10只，將模型復(fù)制成功的大鼠隨機分組，分別為電針?biāo)膯窝ńM、模型組、非經(jīng)非穴組，每組10只。模型復(fù)制不成功的大鼠未列入實驗分析對象。

1.2 儀器

超純水機（美國密理博Milli-Q Reference）；程序控制電針治療儀（PCE-A型）；包埋機（湖北泰微TB-718E）；超薄切片機（德國徠卡EMUC7）；顯微鏡（日本OLYMPUS）；顯微圖像分析（江蘇捷達）。

1.3 模型制備與評定

參照改良寒冷-束縛-饑飽失常綜合法復(fù)制IBS-C模型［9］，使大鼠處于長期應(yīng)激狀態(tài)。（1）束縛敷冰法：將冰棒束于大鼠腹部，融化后及時更換，持續(xù)1 h，期間密切觀察大鼠狀態(tài)。（2）冰水灌胃法：取冰水混合物，按10 mL/kg的劑量灌胃。（3）冰水游泳法：把大鼠置于0℃冰水中游泳，并進行實時動態(tài)觀察，以防大鼠疲倦淹死。（4）饑飽失常法：每逢單日對大鼠進行饑餓處理，正常飲水。以上4種方法，饑飽失常法每天使用，其他3種方法每天使用兩種，如此交替循環(huán)。持續(xù)18 d，若見大鼠糞便變干、變硬、變小，情緒易激惹，毛發(fā)凌亂失去光澤，則說明造模成功［10］。

1.4 治療方法

在前期研究基礎(chǔ)上，選取四單穴：“曲池”、“天樞”、“大腸俞”和“上巨虛”。取穴標(biāo)準(zhǔn)參照常用實驗動物針灸穴位［11］。“天樞”：臍中兩側(cè)旁開約5 mm處；“大腸俞”：第4腰椎下兩側(cè)旁開7 mm處；“上巨虛”：小腿背外側(cè)上2/5折點處；“曲池”：肘關(guān)節(jié)外側(cè)前部凹陷中。針刺方法：雙側(cè)穴位左右交替針刺。針刺時大鼠頭尾及四肢使固定，選用1寸毫針，直刺5 mm，并連至PCE-A型程控電針治療儀。電針參數(shù)：電流（IP-P）為1.5 mA，頻率為2 Hz，連續(xù)電針20 min，1日1次。造模成功后連續(xù)3 d電針。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 內(nèi)臟敏感性 內(nèi)臟感覺狀態(tài)可以用腹部回縮反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）的壓力閾值反映。采用無傷害性結(jié)直腸球囊擴張實驗測定引起大鼠AWR的最小容量閾值。在測試開始前12 h，實驗大鼠禁食不禁水，先用少量異氟烷在密閉玻璃罐中輕度麻醉大鼠，然后潤滑8F導(dǎo)尿管，將導(dǎo)管經(jīng)肛門將插入直腸，球囊末端距肛門約為1 cm，將導(dǎo)管綁在鼠尾根部，固定在合適位置，防其脫出。之后將大鼠置于透明固定器內(nèi)，使其在固定器內(nèi)只能進行小范圍前后活動，大鼠清醒后在籠內(nèi)適應(yīng)20 min，然后用注射器將26～28℃生理鹽水緩慢注入球囊內(nèi)，球囊擴張腸道，誘導(dǎo)結(jié)腸收縮膨脹。當(dāng)觀察到腹壁收縮反射時，記下注射的生理鹽水量，即為該鼠AWR最小容量閾值。間隔15 min重復(fù)操作3次得出平均值。若模型組大鼠AWR最小容量閾值與正常對照組相比明顯降低，說明造模成功。

1.5.2 各組大鼠血清中5-HT、CGRP含量測定 電針干預(yù)后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，打開大鼠腹腔，從腹主動脈取血，離心后取上清液，分裝后-80℃保存［12］。所取血清應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測血清中5-HT、CGRP水平。

1.5.3 各組大鼠結(jié)腸中5-HT、CGRP含量測定 經(jīng)電針干預(yù)后，打開大鼠腹腔，在游離遠端結(jié)腸組織取樣品1 cm，置于甲醛中保存。用免疫組化檢測，記錄吸光度值并進行圖像分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）描述連續(xù)型變量。進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，組間比較符合正態(tài)性采用方差分析；方差齊時用LSD檢驗，方差不齊時Dunnett′T 3檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

正常組大鼠狀態(tài)良好。模型組大鼠情緒易激惹，毛發(fā)發(fā)黃且凌亂，食量減少，糞便數(shù)量減少，質(zhì)地變硬，顏色灰白。電針組大鼠糞便質(zhì)地、性狀明顯改善，數(shù)量增多，毛發(fā)變軟，情緒穩(wěn)定。非經(jīng)非穴組電針后無明顯變化。

2.2 AWR最小容量閾值

與正常對照組比較，模型組AWR最小容量閾值降低（P＜0.05）。與模型組比較，電針?biāo)膯窝ńMAWR最小容量閾值升高（P＜0.05），非經(jīng)非穴組AWR最小容量閾值無明顯變化（P＞0.05）。見表1。

2.3 電針對各組大鼠血清5-HT及CGRP的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清5-HT及CGRP水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，電針?biāo)膯窝ńM大鼠血清5-HT及CGRP水平均降低（P＜0.05），非經(jīng)非穴組血清中5-HT及CGRP水平無明顯差異（P＞0.05）。見表2。

2.4 電針對各組大鼠結(jié)腸5-HT及CGRP的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸5-HT及CGRP水平均升高（P＜0.05）。與模型組比較，電針?biāo)膯窝ńM大鼠結(jié)腸5-HT及CGRP水平明顯降低（P＜0.05），非經(jīng)非穴組結(jié)腸5-HT及CGRP水平無明顯變化（P＞0.05）。見表3。

表1 各組大鼠AWR最小容量閾值（xˉ±s）Tab 1 Minimum AWR volume threshold of rats in each group（xˉ±s）

表2 各組大鼠血清5-HT及CGRP水平比較（n=10，xˉ±s）Tab 2 Serum 5-HT and CGRP concentrations in rats of each group（n=10，xˉ±s）

表3 各組大鼠結(jié)腸中5-HT及CGRP水平比較（n=10，xˉ±s）Tab 3 Comparison of expression level of 5-HT and CGRP in the colon of rats in each group（n=10，xˉ±s）

2.5 免疫組化結(jié)果分析

大鼠結(jié)腸內(nèi)5-HT、CGRP主要表達于黏膜層及黏膜下層，著色細胞呈棕黃色，胞核無色染。與正常組比較，模型組結(jié)腸5-HT、CGRP陽性表達率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。電針?biāo)膯窝ńM結(jié)腸中5-HT、CGRP陽性率表達均降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。非經(jīng)非穴組結(jié)腸中5-HT、CGRP陽性表達率與模型組比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見圖1。

圖1各組大鼠結(jié)腸5-HT、CGRP陽性細胞的表達（×400）Fig 1 Expression of 5-HT and CGRP positive cells in the colon of rats in each group（×400）

3 討論

根據(jù)便秘型腸易激綜合征臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于中醫(yī)“便秘”、“腹痛”的范疇，與飲食不節(jié)、外邪侵襲、情志內(nèi)傷等關(guān)系密切，病位在腸，與肝、脾、胃、腎等臟腑相關(guān)。因其發(fā)病機制不明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療只能緩解癥狀。作為中醫(yī)傳統(tǒng)特色療法之一，針刺治療IBS效果顯著。本研究采取天樞、曲池、上巨虛、大腸俞為治療穴位，并加以電針刺激進行觀察。

《針灸甲乙經(jīng)》曰，“…大腸脹者，天樞主之…”。天樞與大腸俞分別為大腸經(jīng)的募穴、背俞穴，為大腸經(jīng)氣輸注及臟腑經(jīng)氣匯聚之處，因此二穴均可調(diào)節(jié)胃腸功能。《靈樞·衛(wèi)氣》曰“……氣在胸者，止之膺與背俞。氣在腹者，止之背俞……”，俞募配穴亦可發(fā)揮協(xié)同作用。《針灸甲乙經(jīng)》記載“…大腸又熱，腸鳴腹?jié)M，俠臍痛，食不化，……巨虛上廉主之……”。上巨虛是大腸之下合穴，發(fā)于足陽明脈氣，可通調(diào)腸腑、理氣和胃。曲池為大腸經(jīng)之合穴，“合”者匯合，該處氣血充盛，且“經(jīng)脈所過，主治所及”，故曲池可以治療大腸疾病。以上諸穴合用，效果更佳。

5-HT是一種重要的調(diào)節(jié)消化道功能的神經(jīng)遞質(zhì)，與腸道內(nèi)的受體結(jié)合后會刺激胃腸蠕動，引發(fā)腸道分泌、運動等，并與內(nèi)臟的高敏感性聯(lián)系緊密［13］。CGRP是具有神經(jīng)遞質(zhì)等多重功能的神經(jīng)肽，可對胃腸道黏膜的分泌以及運動等功能進行有效調(diào)節(jié)［14］。據(jù)研究，CGRP通過作用于腸段肌肉以及刺激相關(guān)神經(jīng)元釋放抑制型遞質(zhì)從而對胃腸道運動起抑制作用［15-17］。生理狀態(tài)下，5-HT、CGRP合理地參與胃腸功能，使胃腸代謝處于穩(wěn)定的狀態(tài)。而水平異常升高的5-HT和CGRP，不僅會使胃腸功能的調(diào)控能力受損，還會造成了內(nèi)臟高度敏感［18］。內(nèi)臟高敏感性被認(rèn)為是IBS標(biāo)志性特點，在炎癥、應(yīng)激等持續(xù)狀態(tài)下，胃腸相關(guān)神經(jīng)末梢被過度刺激，功能也持續(xù)敏感，5-HT、CGRP都參與了這個高敏化進程。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠AWR最小容量閾值明顯低于正常組，說明IBS-C模型復(fù)制成功，而與模型組相比，電針?biāo)膯窝ńMAWR最小容量閾值顯著升高。酶聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果顯示模型組血清5-HT、CGRP水平與正常組相比明顯增高，電針?biāo)膯窝ńM與模型組相比血清5-HT、CGRP水平顯著下降。免疫組化結(jié)果顯示，與模型組相比，電針?biāo)膯窝ńM結(jié)腸5-HT、CGRP陽性細胞表達顯著降低。說明電針?biāo)膯窝軌蝻@著降低IBS-C模型結(jié)腸和血清中5-HT、CGRP的水平，增強相應(yīng)受體及重吸收轉(zhuǎn)運體表達，調(diào)節(jié)胃腸運動，改善內(nèi)臟敏感狀態(tài)［19］。

本研究關(guān)于電針作用機制探討還不夠深入，因此，針刺干預(yù)便秘型腸易激綜合征大鼠胃腸運動作用機制研究將成為今后研究的重點內(nèi)容。