劉陽，劉琦

南開大學化學院，化學國家級實驗教學示范中心(南開大學)，天津 300071

納米醫(yī)學作為前沿交叉學科，其研究內(nèi)容涵蓋化學、材料學、生物學和醫(yī)學等多個學科[1]。近年來，納米藥物相關研究發(fā)展迅速，特別是針對腫瘤治療中提升藥物生物利用度和降低藥物毒副作用等方面效果顯著，展現(xiàn)出巨大的應用潛力，多個納米藥物已經(jīng)應用于臨床疾病的治療[2,3]。納米藥物最關鍵的部分為納米藥物遞送系統(tǒng)/納米藥物載體，其通常由天然高分子(如多糖、蛋白質(zhì)等)或化學合成材料(如磷脂、聚合物、多孔硅等)構(gòu)成[4–6]。納米藥物載體通常本身沒有生物調(diào)控功能，其主要功能為負載具有生物活性的物質(zhì)(如小分子藥物、基因、多肽等)，并將其運送和釋放于目標組織和細胞，從而使藥物可以高效、準確地富集并作用于目標組織，提升藥物治療效果，同時降低對正常組織的影響，減輕藥物的副作用[7,8]。為實現(xiàn)這個目的，納米藥物載體通常需要通過表面性質(zhì)調(diào)控的方式來適應其所在的生物微環(huán)境，例如可通過提升納米藥物載體表面的正電荷提高其在組織中滲透和進入細胞內(nèi)的效率，或通過對納米載體表面進行聚乙二醇(PEG)修飾延長其血液循環(huán)時間[9]。但在抗腫瘤藥物設計過程中，由于多數(shù)藥物需通過靜脈給藥，其到達腫瘤細胞前必然經(jīng)歷血液循環(huán)、組織滲透及進入細胞等多個不同的生物微環(huán)境，而這些生物微環(huán)境對于納米載體表面性質(zhì)需求不同甚至存在矛盾。因此，如何實現(xiàn)納米藥物載體表面性質(zhì)對生物微環(huán)境的動態(tài)適應，成為這一領域研究的熱點問題，對于納米藥物相關研發(fā)和應用有重要的意義。

近年來，新型環(huán)境響應性聚合物材料的研發(fā)以及自組裝技術的快速發(fā)展為上述問題的解決提供了可行的方案。利用環(huán)境響應性聚合物構(gòu)建的納米藥物載體可隨生物微環(huán)境信號(如溫度、pH、氧化自由基濃度、特定酶含量等)變化改變其表面物理化學性質(zhì)，從而實現(xiàn)對藥物遞送全過程的動態(tài)適應，實現(xiàn)對藥物遞送效率的顯著提升[10,11]。針對抗腫瘤納米藥物的開發(fā)，腫瘤的酸性微環(huán)境(pH < 6.8)是實體腫瘤區(qū)別于正常組織(pH = 7.4)的一個顯著特征[12]。基于這個特征，本實驗設計了一種pH響應納米粒子實現(xiàn)對質(zhì)粒DNA (pDNA)的腫瘤靶向遞送，用以展示實現(xiàn)癌癥基因治療納米藥物體系的設計思路。如圖 1所示，這種 pH響應納米粒子具有核-殼結(jié)構(gòu)，其中內(nèi)核是由聚乙烯亞胺(PEI25K)和pDNA組成的正電性復合物，負電性的 pH響應性聚合物通過靜電相互作用吸附到正電性的PEI25K/pDNA復合物內(nèi)核表面形成聚合物外殼。在正常生理pH條件下，pH響應納米粒子具有一層PEG外殼，但在腫瘤酸性微環(huán)境中，pH響應納米粒子會脫除聚合物殼層暴露出正電性的內(nèi)核。由于腫瘤細胞的細胞膜表面通常帶負電，納米粒子正電性的內(nèi)核可通過靜電相互作用與細胞膜結(jié)合，從而促進腫瘤細胞對納米粒子的攝取[13]。本實驗設計包含pH響應性聚合物的合成，大分子自組裝及pH響應納米粒子的制備，pH響應性能的表征與分析，腫瘤細胞對納米粒子的攝取以及細胞轉(zhuǎn)染等實驗。實驗內(nèi)容貼近目前生物醫(yī)用高分子及納米醫(yī)學領域的研究前沿，有利于激發(fā)學生對科研探索的興趣；另一方面，本實驗涉及化學、材料學以及生物學多學科知識，覆蓋相關研究的基本研究方法和相關實驗操作，可以有效鍛煉學生的綜合實驗能力以及問題分析能力，通過綜合利用多學科研究方法和手段解決實際問題的過程，引導和提高學生的科研創(chuàng)新能力[14,15]。

圖1 pH響應納米粒子的制備以及響應過程示意圖

1 試劑與儀器

試劑：四氫呋喃(分析純)、正己烷(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、乙酸(99%)購自天津渤化化學試劑有限公司；超干二甲基甲酰胺(99.8%)、N-芐氧羰基-L-賴氨酸(98%)購自百靈威科技有限公司；三光氣(99%)、氫溴酸(48%)購自天津希恩思生化科技有限公司；氫氧化鈉(99%)、碳酸鈉(99%)購自天機化學試劑批發(fā)公司；2,3-二甲基馬來酸酐(98%)、丁二酸酐(97%)購自安耐吉化學試劑有限公司；單甲氧基聚乙二醇胺(MW：5000；95%)購自上海金畔生物科技有限公司；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(95%)、羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽(99%)購自美國Invitrogen公司，所有試劑在均無需預處理，直接應用于實驗過程中。

儀器：核磁共振儀(美國Varian公司)、激光共聚焦熒光顯微鏡(日本Olympus公司FV1000)、電動攪拌器(RH basic IKA)、熒光顯微鏡(日本Olympus公司CX41)，動態(tài)激光光散射儀(美國布魯克海文儀器公司BI-200SM)，流式細胞儀(美國Guava公司EasyCyte 8HT)。

2 實驗步驟

2.1 pH響應性聚合物的合成

稱取N-芐氧羰基-L-賴氨酸5.35 g (18.4 mmol)，加入250 mL圓底三口瓶中，同時加入重蒸四氫呋喃(THF) 100 mL，然后緩慢加入溶有8.5 g (27.6 mmol)三光氣(BTC)的THF (50 mL)，在氮氣氛圍保護下，70 °C油浴攪拌條件下反應2 h，待反應液澄清之后，用氬氣除去燒瓶中的殘余BTC。濃縮反應液快速加入預先準備好的過量正己烷中，4 °C靜置沉淀、抽濾得到淡黃色固體，加入適量乙酸乙酯/正己烷混合溶液(體積比為1 : 1)加熱溶解至微沸，趁熱過濾除去不溶物，得到飽和的N-芐氧羰基-L-賴氨酸酐(Lys(Z)-NCA)溶液，靜置析出結(jié)晶，抽濾，得到Lys(Z)-NCA白色固體(產(chǎn)量4.96 g，產(chǎn)率：85%)。將Lys(Z)-NCA (0.98 g，3.2 mmol)溶解在30 mL超干二甲基甲酰胺中，加入單甲氧基聚乙二醇胺(MW：5000，2.0 g，0.4 mmol)作為引發(fā)劑進行開環(huán)聚合。將反應混合物在40 °C下攪拌48 h，然后減壓蒸發(fā)溶劑，所得產(chǎn)物溶于15 mL氯仿中，然后緩慢加入過量的冰乙醚得到mPEG113-b-PLys100(Z)固體。在4 °C條件下，使用氫溴酸/乙酸混合液(體積比為1 : 3，2 mL)溶解mPEG113-b-PLys100(Z)固體，并緩慢滴入到20 mL的三氟乙酸(TFA)中進行脫保護去除mPEG113-b-PLys100(Z)中的芐氧羰基。攪拌反應2 h后，將反應混合物滴加到過量冰乙醚中沉淀得到單甲氧基聚乙二醇-聚賴氨酸嵌段聚合物(mPEG113-b-PLys100)粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物重新溶解在DMF中，使用220 nm微孔過濾器過濾純除去不溶物。濾液繼續(xù)在過量的冰乙醚中沉淀以除去殘留的TFA得到mPEG113-b-PLys100，最后將產(chǎn)物在室溫下真空干燥(合成流程見圖2)。

圖2 pH響應高分子合成流程圖

為了對mPEG113-b-PLys100進行功能化修飾，將100 mg mPEG113-b-PLys100溶解在10 mL pH = 8.5的50 mmol?L?1的碳酸氫鈉緩沖溶液中，然后加入211.2 mg 2,3-二甲基馬來酸酐(DMMA)反應，在整個反應過程中不斷滴加0.2 mol?L?1的氫氧化鈉溶液使整個反應體系的pH保持在8.0–8.5。反應結(jié)束后，使用透析袋(截留分子量：3500 Da)室溫透析(透析液：1 L蒸餾水；換液4次) 24 h將未反應的2,3-二甲基馬來酸酐除去，然后凍干透析袋中液體得到pH響應性聚合物(mPEG113-b-PLys100/DMMA)。同時用丁二酸酐(SA)替代 DMMA按照同樣的方法得到不具有 pH響應性的聚合物 mPEG113-b-PLys100/SA (圖 2)。

2.2 pH響應納米粒子的制備

在室溫下，將 PEI25K和編碼 tdTomato熒光蛋白的 pDNA分別溶解于 PBS中配成 1 mg?mL?1(PEI25K)和 250 μg?mL?1(pDNA)溶液，等體積混合 PEI25K(1 mg?mL?1，0.5 mL)和 pDNA (250 μg?mL?1，0.5 mL)攪拌孵化15 min形成正電性的納米復合物PEI25K/pDNA。隨后將溶于磷酸鹽緩沖液(PB，10 mmol?L?1，pH 7.4)的 pH 響應性高分子 mPEG113-b-PLys100/DMMA (0.5 mL，1 mg?mL?1)與正電性的納米復合物PEI25K/pDNA (1 mL，625 μg?mL?1)混合攪拌15 min得到pH響應性納米粒子。同時使用mPEG113-b-PLys100/SA替代mPEG113-b-PLys100/DMMA按照同樣的方法得到非pH響應納米粒子作為對照。

2.3 pH響應性能測試

聚合物的pH響應性測試：使用氘代水和磷酸二鈉氘分別配制pH 6.5和pH 7.4的氘代磷酸鹽緩沖液(100 mmol?L?1)。將 100 μg 的 mPEG113-b-PLys100/DMMA 和 mPEG113-b-PLys100/SA 分別加入 pH 6.5和pH 7.4的氘代磷酸鹽緩沖液中室溫孵育2 h，然后核磁共振波譜儀對其孵育前后的聚合物進行表征。

納米粒子的pH響應性測試：向pH響應納米粒子(0.5 mg?mL?1，0.2 mL)溶液中分別加入pH 7.4和 pH 6.5 的 PBS (100 mmol?L?1，0.8 mL)室溫攪拌孵育 2 h。同樣，向非 pH 響應納米粒子(0.5 mg?mL?1，0.2 mL)溶液中分別加入pH 7.4和pH 6.5的PB (100 mmol?L?1，0.8 mL)室溫攪拌孵育2 h。然后使用Zeta電位儀測量孵育前后pH響應納米粒子和非pH響應納米粒子表面Zeta電位。

pH響應納米粒子在不同pH下的穩(wěn)定性：向pH響應納米粒子(0.5 mg?mL?1，0.2 mL)溶液中分別加入pH 7.4和pH 6.5的含有10% FBS的PBS (100 mmol?L?1，0.8 mL)并在室溫下孵育，然后使用動態(tài)激光散射儀觀察孵育過程中pH響應納米粒子粒徑的變化。

2.4 腫瘤細胞對pH響應型納米粒子的攝取

MDA-MB-231細胞購自中國科學院上海細胞庫，采用含有 10%熱滅活胎牛血清(FBS)、青霉素(100 units?mL?1)、鏈霉素(100 units?mL?1)的 DMEM 培養(yǎng)基，并在 37 °C 的含有 5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

為了直接觀察腫瘤細胞對納米粒子的攝取，首先向pDNA (0.25 mg?mL?1，2 mL)中加入綠色熒光探針 YOYO-1 溶液(1 mg?mL?1，20 μL)，并在 4 °C 條件下攪拌反應 2 h 得到 YOYO-1 標記的 pDNA。隨后將MDA-MB-231細胞以每孔10000個細胞的密度接種到24孔板中，并在含10% FBS的0.5 mL DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。為了觀察腫瘤細胞在不同條件下對pH響應納米粒子的攝取能力，使用鹽酸將培養(yǎng)基的pH預先調(diào)節(jié)至pH 7.4或6.5。然后分別加入使用YOYO-1 (綠色熒光探針)標記的pDNA 制備的 pH 響應納米粒子(0.5 mg?mL?1，50 μL)和非 pH 響應納米粒子(0.5 mg?mL?1，50 μL)，在不同pH (pH 7.4或者pH 6.5)的培養(yǎng)基中與腫瘤細胞共孵育2 h。孵育結(jié)束后，PBS沖洗三遍并用4%多聚甲醛固定 15 min。按照說明書，繼續(xù)使用 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，藍色)對細胞核進行染色，使用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽(紅色)對細胞膜進行染色。染色結(jié)束后，使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞并拍照。為了定量分析腫瘤細胞對納米粒子的攝取情況，將MDA-MB-231細胞以每孔100000個細胞的密度接種到6孔板中，并在含10% FBS的2 mL DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。為了觀察腫瘤細胞在不同條件下對 pH響應納米粒子的攝取能力，使用鹽酸將培養(yǎng)基的 pH預先調(diào)節(jié)至pH 7.4或6.5。然后分別加入使用YOYO-1 (綠色熒光探針)標記的pDNA制備的pH響應納米粒子(1 mg?mL?1，150 μL)和非 pH 響應納米粒子(1 mg?mL?1，150 μL)，在不同 pH(pH 7.4 或者 pH 6.5)的培養(yǎng)基中與腫瘤細胞共孵育2 h。孵育結(jié)束后，PBS (10 mmol?L?1，2 mL)沖洗三次，每次5 min；然后加入胰蛋白酶(0.25 mg?mL?1，0.5 mL) 37 °C 消化 3 min，消化液離心(800 rpm) 5 min 后用 PBS (500 μL)重懸；最后使用流式細胞儀分析實驗結(jié)果。

2.5 細胞轉(zhuǎn)染實驗

將MDA-MB-231細胞以每孔10000個細胞的密度接種到24孔板中，并在含10%體積胎牛血清(FBS)的0.5 mL DMEM中培養(yǎng)過夜。為了檢測pH響應納米粒子在不同pH條件下的轉(zhuǎn)染能力，預先使用鹽酸將培養(yǎng)基(不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基或者含10% FBS的培養(yǎng)基)的pH調(diào)節(jié)至pH 7.4或6.5。轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)基替換為不同pH (pH 7.4或6.5)的新鮮培養(yǎng)基(不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基或者含10%FBS的培養(yǎng)基)，將 pH 響應納米粒子(0.5 mg?mL?1，50 μL)和非 pH 響應納米粒子(0.5 mg?mL?1，50 μL)加入到孔板中與細胞共培養(yǎng)。孵育4 h后，將培養(yǎng)基換成0.5 mL含10%體積FBS的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。使用PEI25K/pDNA復合物作為陽性對照進行相同處理。實驗結(jié)束時，將細胞用PBS沖洗。通過熒光顯微鏡檢測tdTomato熒光蛋白的表達并拍照。

3 結(jié)果與討論

3.1 pH響應型高分子的合成與pH響應性

按上述過程合成mPEG113-b-PLys100、mPEG113-b-PLys100/DMMA和mPEG113-b-PLys100/SA后，將合成產(chǎn)物溶解在氘代水中，使用核磁共振譜儀進行表征。如圖3A所示，峰b對應mPEG113-b-PLys100中PEG兩個亞甲基上的4個H，峰c對應mPEG113-b-PLys100中賴氨酸次甲基上的一個H，根據(jù)峰b和峰c面積比值即可算出賴氨酸的聚合度。對mPEG113-b-PLys100的側(cè)鏈進行DMMA和SA修飾后，可以根據(jù)核磁譜圖的變化來確定修飾結(jié)果。如圖 3B所示，峰 f對應 mPEG113-b-PLys100/DMMA中DMMA上兩個甲基上的6個H，由此可以確定mPEG113-b-PLys100/DMMA的成功合成。同理，在圖3C中，峰f對應mPEG113-b-PLys100/SA中SA上兩個次甲基上的4個H，表明了mPEG113-b-PLys100/SA的成功合成。

圖3 mPEG113-b-PLys100、mPEG113-b-PLys100/DMMA和mPEG113-b-PLys100/SA的核磁共振氫譜

為了表征mPEG113-b-PLys100/DMMA的pH響應性，將mPEG113-b-PLys100/DMMA溶解在不同pH的氘代磷酸緩沖液中(100 mmol?L?1，pH 7.4或pH 6.5)并孵育2 h，然后使用核磁共振譜儀進行表征。如圖4A所示，Ha峰和Hb峰分別對應與酰胺鍵和氨基相鄰的亞甲基上兩個H的特征峰，mPEG113-b-PLys100/SA在 pH 7.4和 pH 6.5的條件下孵育 2 h后核磁譜圖沒有發(fā)生變化。但是，mPEG113-b-PLys100/DMMA在pH 6.5的環(huán)境下孵育2 h后，Hb峰的面積的明顯大于Ha峰的面積，說明mPEG113-b-PLys100/DMMA在酸性環(huán)境中發(fā)生水解導致DMMA基團發(fā)生解離。

圖4 mPEG113-b-PLys100/SA (A)和mPEG113-b-PLys100/DMMA (B)在不同pH下的核磁共振氫譜

3.2 pH響應納米粒子的制備與pH響應性

pH響應納米粒子具有核-殼結(jié)構(gòu)，內(nèi)核是由pDNA和 PEI25K形成的正電性復合物，外殼是pH響應性聚合物mPEG113-b-PLys100/DMMA。為了更好地驗證pH響應納米粒子的pH響應性，通過相同的方法使用非pH響應性聚合物mPEG113-b-PLys100/SA制備非pH響應納米粒子作為對照組。隨后，使用動態(tài)光散射和透射電鏡對納米粒子進行了表征。如圖5A和圖5B所示，pH響應納米粒子和非pH響應納米粒子的為粒徑大約130 nm的球形納米顆粒。

圖5 pH響應納米粒子(A)和非pH響應納米粒子(B)的動態(tài)光散射和電鏡數(shù)據(jù)(標尺：100 nm)

圖4中結(jié)果表明 mPEG113-b-PLys100/DMMA在酸性(pH 6.5)環(huán)境中會發(fā)生水解，導致含羧基的DMMA基團的解離，從而暴露出大量的氨基使mPEG113-b-PLys100/DMMA由負電性聚合物轉(zhuǎn)換為正電性聚合物。因此，由mPEG113-b-PLys100/DMMA構(gòu)成的pH響應納米粒子在酸性環(huán)境中會由于電荷排斥作用脫除表面的聚合物殼層，暴露出正電性的內(nèi)核。如圖6A所示，pH響應納米粒子在pH 6.5的環(huán)境中，表面電荷發(fā)生了明顯的轉(zhuǎn)變，由?12.5 mV變?yōu)?0.4 mV。而由非pH響應型的mPEG113-b-PLys100/SA形成的納米粒子則不存在表面電荷的轉(zhuǎn)變。這種微環(huán)境引發(fā)的聚合物殼層脫除，使得pH響應納米粒子在血液循環(huán)過程中擁有PEG化的外層以及負電性的表面電位，利于在血液循環(huán)中保持穩(wěn)定。當納米粒子進入腫瘤組織后，其PEG殼層在腫瘤微環(huán)境中微酸性的刺激下脫除并暴露出正電性的內(nèi)核，有利于pDNA在腫瘤組織中的富集以及被腫瘤細胞攝取。為了驗證pH響應納米粒子在正常生理環(huán)境中的穩(wěn)定性，我們測試了pH響應納米粒子在不同pH的PBS (含有10% FBS)中粒徑的變化。如圖6B所示，在pH 7.4條件下，pH響應納米粒子的粒徑無明顯變化，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。但是在pH 6.5條件下，pH響應納米粒子的粒徑顯著增大，這是由于pH響應納米粒子在酸性環(huán)境下脫除PEG殼層暴露出正電性的內(nèi)核，其與蛋白間的非特異性吸附引起納米離子和血清蛋白之間的團聚。

圖6 (A) pH響應納米粒子和非pH響應納米粒子在不同pH條件下的Zeta電位；(B) pH響應納米粒子在不同pH含有10% FBS的PBS中粒徑的變化

3.3 腫瘤細胞對pH響應性納米粒子的攝取

為了測試腫瘤細胞在不同pH條件下對pH響應納米粒子的攝取情況，將YOYO-1 (綠色熒光探針)標記的pH響應納米粒子在不同pH條件下與MDA-MB-231細胞共同培養(yǎng)2 h，隨后使用激光共聚焦顯微鏡對其進行觀察。YOYO-1標記的非pH響應納米粒子進行相同處理作為對照組。如圖7A所示，與在pH 7.4環(huán)境中培養(yǎng)相比，在pH 6.5的環(huán)境中腫瘤細胞對pH響應納米粒子的攝取明顯增強，這是由于在酸性環(huán)境中pH響應納米粒子可以脫除表面PEG殼層并暴露出正電性的內(nèi)核，促進了細胞對納米粒子的內(nèi)吞作用。但是，腫瘤細胞在不同pH條件下對非pH響應納米粒子的攝取則沒有表現(xiàn)出明顯的差異，這是由于該納米粒子在不同pH環(huán)境中均呈現(xiàn)PEG包裹的負電表面，不利于細胞對納米粒子的內(nèi)吞作用。流式細胞術的分析結(jié)果(圖7B和7C)同樣驗證了這些結(jié)論。

圖7 腫瘤細胞對在pH條件下對pH響應納米粒子的攝取

3.4 pH響應納米粒子對腫瘤細胞的轉(zhuǎn)染

為了檢測pH響應納米粒子在不同pH條件下對腫瘤細胞的轉(zhuǎn)染能力，使用編碼tdTomato熒光蛋白的pDNA制備pH響應納米粒子和非pH響應納米粒子并與MDA-MB-231細胞共同培養(yǎng)，隨后使用熒光顯微鏡觀察tdTomato熒光蛋白的表達情況。如圖8所示，與在pH 7.4環(huán)境使用pH響應納米粒子處理的腫瘤細胞相比，在pH 6.5的環(huán)境中使用pH響應納米粒子處理的腫瘤細胞中觀察到更強的熒光蛋白表達。但是，在兩種pH條件下使用非pH響應納米粒子處理腫瘤細胞都只能觀察到較弱的熒光蛋白表達，這與細胞攝取的結(jié)果一致。更重要的是，在轉(zhuǎn)染過程中加入10%的FBS并沒有影響pH響應納米粒子對腫瘤細胞的轉(zhuǎn)染，表明了pH響應納米粒子在體內(nèi)實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染的潛力。

圖8 pH響應納米粒子和非pH響應納米粒子對腫瘤細胞的轉(zhuǎn)染(標尺：50 μm)

4 實驗內(nèi)容拓展

本實驗可以根據(jù)實驗課時以及實驗條件的變化進行拓展，包括以下內(nèi)容：

(1) 使用具有抑制腫瘤細胞增殖功能的pDNA制備pH響應納米粒子，并驗證其在不同pH條件下對腫瘤細胞增殖的抑制效果；

(2) 使用熒光探針標記pH響應納米粒子并通過尾靜脈注射入荷瘤小鼠體內(nèi)，通過小動物活體成像系統(tǒng)觀察納米粒子在腫瘤部位的富集效果；

(3) 荷瘤小鼠通過尾靜脈注射負載抑制腫瘤細胞增殖功能的pDNA的pH響應納米粒子驗證其在體內(nèi)抑制腫瘤生長的效果。

5 教學方法和實驗注意事項

本實驗涉及內(nèi)容較多，內(nèi)容涉及多個不同的學科。其中納米粒子表征方法、納米粒子基因轉(zhuǎn)染效率的評估方面，本文給出了不同的實驗方法，在具體教學時可根據(jù)課時數(shù)量、相關設備保障情況、以及參與課程學生的學科背景和基礎進行靈活調(diào)整。本實驗建議每位教師指導13–15位學生，并將學生以4–5人分為一組進行實驗。建議本實驗分6周完成，總學時設定為36學時。學生需要在實驗之前分組進行文獻調(diào)研。在第一周的6個學時中，先進行3–4個學時的背景知識討論，分享學習納米醫(yī)學的最新進展以及熱點問題。剩余的2–3個學時討論確定pH響應性聚合物的合成方案以及實驗注意事項。由于 pH響應性聚合物具有多種合成路線和方法，具體方案可根據(jù)實際條件決定，也可為不同組學生安排不同的合成路線進行對比和討論，本文提供的方案是可選方案之一。第二周的6個學時合成pH響應性聚合物，對于長時間的反應，學生可在課上時間架設反應，經(jīng)任課教師檢查確保無誤后，可由小組內(nèi)學生在課余時間輪流看管，反應結(jié)束后的透析提純和冷凍干燥處理過程同樣需要較長的時間，可安排學生輪流到實驗室進行換透析液、取凍干樣品等操作。第三周對所合成的pH響應性聚合物進行核磁表征并研究其pH響應性能。第四周制備和表征pH響應納米粒子，本周實驗中如有條件安排利用 TEM 對納米離子形貌進行觀察，建議增加課時。第五周主要學習細胞實驗基本操作，并明確相關注意事項。同時本周實驗中應指導和確保學生制備好用于細胞實驗的納米粒子，供下周實驗使用。第六周將利用腫瘤細胞對所制備的 pH響應納米粒子的細胞攝取能力和轉(zhuǎn)染能力進行研究。這里可根據(jù)實驗室所具有的條件，使用激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀觀察和分析腫瘤細胞在不同pH條件下對pH響應納米粒子的攝取和基因轉(zhuǎn)染情況。本周實驗可安排同組學生分別采用共聚焦顯微鏡和流式細胞分析的方法，并引導學生就兩種方法的優(yōu)缺點進行討論。如果希望每位學生兩種方式都進行，則需要適當增加課時。最終實驗報告要求以論文形式提交，內(nèi)容包括背景介紹、實驗材料與方法、實驗結(jié)果與討論、實驗總結(jié)等。

實驗注意事項：(1) 本實驗中所用的三光氣、氫溴酸、三氟乙酸有毒性或較強的腐蝕性，必須在通風櫥中取用并做好防護措施；(2) 合成mPEG113-b-PLys100中所用的二甲基甲酰胺必須是超干溶劑，否則會降低嵌段聚合物的聚合度；(3) 用于細胞轉(zhuǎn)染實驗的pH響應納米粒子在與細胞共培養(yǎng)前需使用針式過濾器(Φ = 0.45 μm)除菌，避免細胞染菌影響轉(zhuǎn)染效率。

6 結(jié)語

隨著納米技術的持續(xù)發(fā)展和對腫瘤微環(huán)境了解的不斷深入，基于腫瘤微環(huán)境設計的響應性納米藥物遞送系統(tǒng)已經(jīng)成為納米醫(yī)學的熱點問題。這種環(huán)境響應性納米藥物遞送系統(tǒng)在正常生理環(huán)境下具有良好的穩(wěn)定性，到達腫瘤組織后受到腫瘤微環(huán)境刺激載體性能(包括表面電勢、親疏水性、尺寸等)發(fā)生改變，實現(xiàn)藥物在腫瘤組織高效、準確地富集，提升藥物治療效果，同時降低對正常組織的影響，減輕藥物的副作用。這一類納米載體的設計，其關鍵問題在于腫瘤微環(huán)境特異性生物信號的選取，以及與之對應的刺激響應性高分子材料的設計與合成。目前，較為常用的腫瘤微環(huán)境特征性生物信號包括較低的pH、較高的氧化自由基濃度、特定酶(如金屬蛋白酶-2等)表達量的上調(diào)等，這些生物信號均可以被用作區(qū)別腫瘤組織與正常組織的生物信號，其合理識別和利用將有利于提高納米藥物遞送載體的腫瘤特異性。本實驗以識別腫瘤微環(huán)境酸性為例，展示了一種 pH響應納米粒子的制備方法，并利用該納米離子實現(xiàn)了對質(zhì)粒 DNA的高效胞內(nèi)遞送。實驗設計面向以化學為基礎的前沿交叉學科，將當前高分子化學與材料中最新的科研成果“返哺”于實驗教學，傳授和訓練學生高分子化學與生物醫(yī)用材料相關基本實驗技能的同時，使學生可以直觀地了解到當前高分子化學的前沿研究領域，掌握相關的基本研究方法和研究思路，有效填補當前實驗教學與科學研究之間的空白，增強學生對于從事相關領域研究工作的自信心。同時，本實驗設計以聚合物化學合成為基礎，逐步引導學生利用所合成聚合物通過自組裝的方法構(gòu)建納米粒子，并引入多種測試表征手段對聚合物及納米粒子的理化性質(zhì)和生物行為進行研究和表征，內(nèi)容豐富，并使學生有機會接觸NMR、激光光散射、TEM、熒光顯微鏡等大型儀器，使學生可以直觀地了解到自己所合成材料的性質(zhì)和功能，提升學生對于相關研究的興趣。最后，通過對測試結(jié)果的分析討論，可以使學生認識到高分子材料結(jié)構(gòu)和性能之間的聯(lián)系，從而建立對聚合物材料理性設計更為深刻的認識。本綜合實驗可使學生體驗科學研究的具體過程，可有效引導學生完成從本科階段的課程學習到科學研究創(chuàng)造的轉(zhuǎn)換。