王兆濤 徐如祥 馬全紅 王業(yè)忠 姬云翔

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科（廣州510260）；2四川省人民醫(yī)院神經(jīng)外科（成都610072）；3蘇州大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所（江蘇蘇州215123）

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的退行性病變［1］。腦內(nèi)Aβ斑塊的形成是AD 最主要的病理特征之一，其最終將導(dǎo)致神經(jīng)元突觸喪失，影響AD 患者的學(xué)習(xí)和記憶能力［2-4］。因此，針對減少Aβ和神經(jīng)元突觸的喪失是一種治療AD 的有效方式［5］。研究表明：AD 是一種基因異質(zhì)性疾病，涉及多種分子的調(diào)控和信號通路的改變［4，6-9］。精神分裂斷裂基因1（DISC1）最早被發(fā)現(xiàn)于家族性精神分裂病中，現(xiàn)已被證明是多種神經(jīng)和精神疾病的遺傳危險因子。近年來，越來越多的臨床數(shù)據(jù)證明，DISC1 與AD 的發(fā)病存在相關(guān)性［10］。但關(guān)于DISC1 在AD 發(fā)病中的機(jī)制的報道仍十分罕見。APP/PS1小鼠是最常用的研究AD的模型小鼠之一，隨著年齡增長，此小鼠腦內(nèi)逐漸產(chǎn)生Aβ斑塊。因此，本研究將利用小鼠原代神經(jīng)元和APP/PS1 的AD 小鼠模型，通過過表達(dá)DISC1，探索DISC1 對AD 突觸喪失和Aβ斑塊生成的作用，同時探索其對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠及其同窩對照C57BL/6J小鼠購自南京大學(xué)模式生物研究所。

1.1.2 腦組織樣本AD 患者和年齡匹配的非AD患者的腦樣本受贈于美國凱斯西儲大學(xué)。所有患者均由神經(jīng)科醫(yī)生診斷，驗尸死亡后3 ～21 h 收集大腦樣本。

1.1.3 主要試劑高糖DMEM 培養(yǎng)基、10%胎牛血清、B27、bFGF、EGF、胰蛋白酶、青鏈雙抗、鼠抗Aβ抗體、兔抗人DISC1 抗體、鼠抗人GAPDH 單克隆抗體（美國賽默飛公司），Aβ肽（美國Abcam 公司）。DISC1 慢病毒及腺相關(guān)病毒由上海和元生物技術(shù)有限公司構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組體外培養(yǎng)野生型C57 胎鼠神經(jīng)元，分為GFP 組（轉(zhuǎn)染GFP 對照病毒）、GFP+Aβ組（轉(zhuǎn)染GFP 對照病毒后進(jìn)行Aβ處理）、DISC1 + Aβ組（轉(zhuǎn)染DISC1 過表達(dá)病毒后進(jìn)行Aβ處理），每組重復(fù)5 次，檢測神經(jīng)元樹突棘情況；取2月齡的C57 小鼠，立體定向海馬分別注射GFP 對照病毒和DISC1 過表達(dá)病毒，隨后切腦片，Aβ處理后分成3 組，即對照組（立體定向海馬注射GFP 對照病毒）、Aβ處理組（立體定向海馬注射GFP 對照病毒后用Aβ處理）、DISC1+Aβ處理組，每組5 只，使用膜片鉗技術(shù)檢測各組的長時程增強(qiáng)（LTP）；C57 小鼠分為WT+GFP 組（野生型小鼠海馬注射GFP 對照病毒）、TG+GFP 組（APP/PS1 小鼠海馬注射GFP對照病毒）、TG+DISC1 組（APP/PS1 小鼠海馬注射DISC1 過表達(dá)病毒）三組，每組5 只，免疫熒光染色檢測小鼠腦中Aβ斑塊沉積，Morris 水迷宮檢測各組小鼠學(xué)習(xí)能力。

1.2.2 Western blot用1×RIPA裂解液（加入1×蛋白酶抑制劑，康為世紀(jì)，中國）裂解腦組織。測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度上樣，每孔上樣30 μg。通過10%SDS?PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)樣品，并通過轉(zhuǎn)移緩沖液將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。 然后在室溫下用含有5%BSA 的1×TBST 封閉膜1 h，然后在用5%BSA（1×TBST）稀釋的一抗（1∶1 000）中4 ℃孵育過夜。之后，將膜與過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1×TBST 溶液中1∶10 000 稀釋）孵育1 h。隨后1×TBST 洗膜，3 次5 min。最后使用ECL 化學(xué)發(fā)光法（Merck millipore，德國）檢測，使用Image?pro plus計算條帶的灰度。

1.2.3 胎鼠原代神經(jīng)元分離培養(yǎng)分離胚胎14 ～16 d 的小鼠海馬和皮層，用含0.01% DnaseI 的0.25%的胰酶在37 ℃消化10 min。組織塊轉(zhuǎn)到含10%胎牛血清的DMEM 中，吹打、離心、重懸后，將細(xì)胞種在多聚賴氨酸包被的孔板中。細(xì)胞培養(yǎng)液為含有B27 的Neurobasal Medium。細(xì)胞接種24 h后，用3 × 10-7M 的阿糖胞苷處理細(xì)胞抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長。

1.2.4 Aβ寡聚體的制備和Aβ處理Aβ42 是所有Aβ中毒性最大的，寡聚化的Aβ42 具有更高的毒性，用Aβ42 寡聚體處理體外細(xì)胞可以很好的模擬Aβ 在體內(nèi)的毒性效應(yīng)。Aβ 寡聚體的制備：在室溫下將1.0 mg 人工合成的Aβ42 在六氟異丙醇（HFIP）中溶解至1 mmol/L，孵育60 min。在Speed Vac（Sc110 Savant Instruments）中真空除去HFIP，并將凍干的肽膜在-20 ℃下干燥儲存。然后用DMSO將干燥的肽膜溶解至5 mmol/L 作為貯存液。最后，將儲備溶液用PBS 進(jìn)一步稀釋至1 μmol/L 作為最終濃度，將其在37 ℃下培養(yǎng)5 d 以獲得成熟的寡聚體。Aβ處理：將制備好的寡聚體加入培養(yǎng)基中，使寡聚體的濃度為10 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間。

1.2.5 樹突棘密度分析小鼠元代神經(jīng)元培養(yǎng)14 d 后，用GFP 對照慢病毒或DISC1 過表達(dá)慢病毒感染神經(jīng)元。將病毒感染的神經(jīng)元培養(yǎng)1 周，并用1 μmol/L Aβ42 寡聚物或DMSO 處理12 h。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，并通過激光共聚焦顯微鏡獲取圖像。然后將圖像輸入到Image Pro?Plus 軟件中，計算每單位長度樹突棘的數(shù)量。

1.2.6 小鼠海馬立體定向注射小鼠異氟烷麻醉后固定在立體定位架上，將小鼠頭皮膚切開，用小鼠顱骨磨鉆在顱骨上鉆一小孔，用10 μL 規(guī)格的針以0.2 μL/ min 的速率將2 μL 病毒懸浮液注射到小鼠雙側(cè)海馬中（定位點：前囟點后2.1 mmol/L，前囟點兩側(cè)±1.8 mmol/L，向下1.8 mmol/L）。 注射后，將針再放置5 min，然后緩慢取出。

1.2.7 膜片鉗檢測小鼠海馬LTP使用振動切片機(jī)（Leica VT1200S）從切除的小鼠腦制備橫向海馬切片（400 μm）。在室溫下將切片保持在用95%O2和5%CO2鼓泡的人工腦脊液中至少1 h，然后移至浸入式記錄室，該浸沒式記錄室以1e2mL/min 的速率連續(xù)灌注氧合腦脊液。通過填充有3 mol/L NaCl 的玻璃微電極（Frederick Haer Co）在海馬DG區(qū)的分子層中記錄興奮性突觸后電位（fEPSP）。將刺激和記錄電極置于齒狀回的分子層中。調(diào)整選擇用于基線測量的刺激脈沖（0.2 ms 持續(xù)時間，0.033 Hz）以產(chǎn)生其最大斜率的40%。在基線反應(yīng)穩(wěn)定30 min 后，使用高頻刺激誘導(dǎo)長時程增強(qiáng)（LTP，5 個100 Hz 和1 s 列車間隔20 s）。用Axon multiclamp 700B 放大器獲得電生理學(xué)數(shù)據(jù)，以0.1e5KHz 過濾，并以10 KHz 數(shù)字化，并使用pClamp10.3軟件（Molecular Devices Corp，USA）離線測量和分析fEPSP 的斜率。對照培養(yǎng)基含有：120 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L KCl、1.25 mmol/L NaH2PO4、26 mmol/L NaHCO3、1.3 mmol/L MgSO4、2.5 mmol/L CaCl2、10 mmol/L d?葡萄糖，所有溶液均含有100 μm 印防己毒素（Sigma，St.Louis，MO）。

1.2.8 Morris 水迷宮實驗小鼠每天給予4 個測試。每次測試由不同的位置開始。每個測試的時間為90 s。連續(xù)5 d 記錄小鼠的逃離潛伏期（從起始點到目的平臺游泳所需的時間）、路徑（從起始點到目的平臺的游泳軌跡）。第6 天撤掉平臺，記錄小鼠穿過原平臺所在位置的次數(shù)，評價檢測小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

1.2.9 免疫熒光染色檢測Aβ斑塊沉積提取小鼠腦組織于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水包埋制備切片，切片經(jīng)清洗、血清封閉。一抗（Aβ抗體，1∶1 000）4 ℃孵育過夜。滴加熒光二抗，室溫孵育1 h。DAPI 復(fù)染細(xì)胞核。熒光顯微鏡觀察并拍照。用Image?Pro Plus 圖像分析軟件分別測定每張切片Aβ斑塊的面積。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD 方法，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DISC1 在AD 患者腦皮層中表達(dá)與年齡相匹配的非AD 患者相比，AD 患者皮層中100 ～130 kDa的DISC1亞型水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 DISC1 在人腦中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of DISC1 in the human brains

2.2 過表達(dá)DISC1 對突觸可塑性的影響與GFP組比較，GFP+Aβ組樹突棘數(shù)量減少，而DISC1+Aβ組較GFP+Aβ組樹突棘數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2A、B。長時程增強(qiáng)（LTP）是突觸傳遞功能可塑性的重要評價指標(biāo)。對海馬注射GFP 對照慢病毒及DISC1 過表達(dá)慢病毒的腦切片進(jìn)行Aβ處理，膜片鉗檢測其LTP。結(jié)果顯示，GFP+Aβ組小鼠腦切片的LTP 較GFP 組減弱，而過表達(dá)DISC1 后再行Aβ處理，LTP 較Aβ+GFP 組增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2C、D。以上結(jié)果表明：DISC1 減弱了Aβ誘發(fā)的樹突棘喪失及對突觸可塑性的毒性作用。

2.3 過表達(dá)DISC1 對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ斑塊沉積的影響在8月齡的APP/PS1 小鼠海馬中注射GFP 對照及DISC1 過表達(dá)腺相關(guān)病毒，6 個月后，免疫熒光染色檢測各組小鼠腦皮層及海馬Aβ斑塊沉積情況。與TG+GFP 組比較，TG+DISC1組小鼠海馬老年斑面積明顯減少（P＜0.05），而兩組皮層的老年斑面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明過表達(dá)DISC1 能改善APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ斑塊的沉積。見圖3。

圖2 過表達(dá)DISC1 對突觸可塑性的影響Fig.2 Effects of overexpression of DISC1 on synaptic plasticity

圖3 過表達(dá)DISC1 對APP/PS1 小鼠海馬Aβ斑塊沉積的影響Fig.3 Effects of overexpression of DISC1 on Aβ plaque deposition in APP/PS1 transgenic mice

2.4 過表達(dá)DISC1 對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的影響在8月齡的APP/PS1 小鼠海馬中注射GFP 對照及DISC1 過表達(dá)腺相關(guān)病毒，6 個月后使用Morris 水迷宮評價各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。各組小鼠尋找平臺逃避潛伏期隨著時間的延長逐漸縮短。在第5 天時，與WT + GFP 組比較，TG + GFP 組的逃避潛伏期更長（P＜0.05），而TG+DISC1 過表達(dá)組較TG+GFP 組的逃避潛伏期縮短（P＜0.05）；同時在撤掉平臺后，與WT+GFP組比較，TG+GFP組穿越平臺的次數(shù)更少（P＜0.05），而TG + DISC1 過表達(dá)組較TG + GFP 組穿越平臺的次數(shù)多（P＜0.05），表明過表達(dá)DISC1 改善了APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。見圖4。

3 討論

AD 是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性的認(rèn)知功能缺陷和行為能力障礙，嚴(yán)重影響患者日常生活水平，本病從明確診斷到患者死亡通常只有3 ～9年的時間。目前全球有超過5 000 萬AD 患者，而且患者數(shù)量還在不斷增加，給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［11］。隨著人口老齡化的不斷加劇，AD 的發(fā)病率越來越高［1］。AD 病因復(fù)雜，且目前沒有確切的治療方法。因此，亟需探索其發(fā)病機(jī)制并尋找有效的治療方法。

圖4 Morris 水迷宮實驗檢測過表達(dá)DISC1 對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)能力的影響Fig.4 Effects of overexpression of DISC1 on Morris water maze experiment in APP/PS1 transgenic mice

目前AD 的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，其發(fā)病涉及多種分子的改變。以往的研究發(fā)現(xiàn)，DISC1 是包括精神分裂癥、重性抑郁和雙相精神障礙在內(nèi)的多種精神疾病的遺傳風(fēng)險基因［12-15］。最近幾年，DISC1 與AD 發(fā)病的關(guān)系越來越受到關(guān)注：ZHANG等［10］報道DISC1 與中國北方漢族AD 的發(fā)病存在相關(guān)性；SHAHANI 等［16］報道DISC1 可以調(diào)控淀粉蛋白前體APP 在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運；并且先前實驗也證實，DISC1 在8 個月的AD 小鼠腦中低表達(dá)［17-18］。由于存在可變剪接，DISC1 具有多種亞型。 在蛋白質(zhì)水平上，檢測到的大多數(shù)DISC1 亞型在100 ～130 kDa 之間，這些是其發(fā)揮主要作用的亞型。在70 ～85 kDa 處也觀察到較小的DISC1 亞型。本研究中發(fā)現(xiàn)，DISC1 在AD 患者大腦中的表達(dá)較年齡性別相匹配的非AD 患者的表達(dá)水平更低，提示DISC1 可能是一個與AD 發(fā)病相關(guān)的重要因子。

腦內(nèi)Aβ斑塊的形成與異常沉積是導(dǎo)致AD 病理進(jìn)展的一個關(guān)鍵因素，腦內(nèi)Aβ斑塊的沉積可導(dǎo)致神經(jīng)元樹突棘喪失，神經(jīng)突觸進(jìn)行性減少，最終導(dǎo)致AD 患者學(xué)習(xí)記憶能力下降。樹突棘（dendrit?ic spine）是樹突分枝上的棘狀突起，是神經(jīng)元間形成突觸的主要部位。在學(xué)習(xí)記憶過程中，突觸可塑性常與樹突棘的形成、脫落、擴(kuò)張和萎縮等形態(tài)變化相伴發(fā)生。本研究將培養(yǎng)的原代胎鼠神經(jīng)元進(jìn)行Aβ處理，體外模擬Aβ對神經(jīng)元的毒性作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)DISC1 能夠挽救Aβ造成的樹突棘的喪失及長時程增強(qiáng)（LTP）的抑制，提示DISC1 在AD 的發(fā)病過程中可能通過改善突觸的可塑性發(fā)揮延緩AD 進(jìn)展的作用。

目前，大量的基礎(chǔ)研究致力于減少Aβ生成而改善AD 患者的學(xué)習(xí)記憶能力［19-20］。先前的研究中發(fā)現(xiàn)，在4月齡的APP/PS1 小鼠海馬中（此時海馬中尚未有明顯的Aβ斑塊形成）過表達(dá)DISC1，8月齡時檢測，其可以有效減少Aβ斑塊的沉積，并提高AD 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，在8月齡的APP/PS1 小鼠海馬中（此時海馬中已經(jīng)有明顯的Aβ斑塊沉積）過表達(dá)DISC1，6 個月后檢測，其仍可以有效減少Aβ斑塊的沉積并提高其學(xué)習(xí)記憶能力。以上結(jié)果提示，過表達(dá)DISC1 不僅可以在早期預(yù)防腦內(nèi)Aβ斑塊的沉積及改善其學(xué)習(xí)記憶能力，并且對已經(jīng)有穩(wěn)定Aβ斑塊沉積的AD 患者仍有減少Aβ斑塊沉積及改善其學(xué)習(xí)記憶能力的作用，其中涉及的更深入機(jī)制，需要在將來的研究中進(jìn)一步探索。雖然本實驗在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小腦內(nèi)過表達(dá)DISC1，證明DISC1 有效減少了Aβ的生成，但其不能完全模仿生理狀態(tài)下沒有DISC1 作用時Aβ的生成情況，因此，在后續(xù)的實驗中希望能夠構(gòu)建DISC1 的敲除鼠并將APP/PS1 小鼠與其雜交產(chǎn)生DISC1 敲除的APP/PS1 小鼠，從而進(jìn)一步在體內(nèi)研究DISC1 對AD 小鼠Aβ斑塊的形成。

綜上所述，腦內(nèi)DISC1 水平下調(diào)可能是AD 發(fā)病的一個重要危險因子，過表達(dá)DISC1 能夠通過減少腦內(nèi)Aβ斑塊沉積及減弱Aβ斑塊沉積造成的樹突棘喪失和LTP 抑制，從而提高AD 小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。本研究挖掘了DISC1 作為AD 治療靶點的潛能，為AD 的治療提供了理論基礎(chǔ)。