徐曉峰 羅漢將 莫瓊 左麗絲 黃秀仙 陳敏

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)實驗室，廣西神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床研究中心，廣西腦與認知神經(jīng)科學(xué)重點實驗室（廣西桂林541001）

帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）是常見的好發(fā)于中老年人的神經(jīng)退行性疾?。?］，PD 患者的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)及腸神經(jīng)系統(tǒng)均出現(xiàn)α?突觸核蛋白（α?synuclein，α?Syn）異常表達、聚集和多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元變性［2-3］。現(xiàn)有PD 動物模型研究證明，黑質(zhì)致密部酪氨酸羥化酶（tyro?sine hydroxylase，TH）陽性神經(jīng)元減少及紋狀體DA含量降低，多巴胺受體D1（dopamine receptor D1，D1DR）表達下降［4-5］。而結(jié)腸等消化器官中D1DR的表達是否發(fā)生變化尚不清楚。異常增加的α?Syn 是否影響腦及結(jié)腸中D1DR 的表達亦未探明。然而，DA 及DR 在胃腸道的表達對胃腸運動、胃酸分泌、胃黏膜血氧供應(yīng)等胃腸功能的調(diào)節(jié)起重要作用［6］。因此明確PD 發(fā)生時胃腸道D1DR 的改變對PD 非運動癥狀發(fā)生機制的探索有重要臨床意義。本研究擬通過C57BL/6J 小鼠紋狀體內(nèi)注射α?Syn 預(yù)成型纖維（pre?formed fibrils，PFF）建立PD 動物模型，探索異常增加的α?Syn 所致黑質(zhì)和結(jié)腸中D1DR 變化的潛在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物野生C57BL/6J雄性小鼠16只，8周齡，體質(zhì)量約25 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動物研究中心，恒溫恒濕，自由飲食、飲水。實驗及實驗中外科手術(shù)均符合實驗動物護理和使用研究指南，并已獲得桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（No.2019?0010）。

1.2 主要試劑及儀器α?Syn PFF（StressMarq，加拿大），D1DR 抗體（DF7097，Affinity，美國），α?Syn抗體（610787，BD，美國），TH 抗體（AB152，Milli?pore，美國），β?actin 抗體（C1313，北京普利萊，中國），Alexa?fluor 488 標(biāo)記山羊抗兔IgG、兔SPN 試劑盒（ZF0511、SPN?9001，北京中杉金橋，中國），腦立體定位儀（深圳瑞沃德，中國），小鼠曠場實驗分析系統(tǒng)（上海欣軟，中國），熒光顯微鏡（Nikon，日本），ODYSSEY 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（LI?COR，美國）。

1.3 動物模型制備通過行為學(xué)訓(xùn)練，選取運動能力接近的16 只C57BL/6J 小鼠，隨機分為對照組（n= 8）和模型組（n= 8）。用4%的水合氯醛麻醉后，通過立體定位注射將2 μL 1 mg/mL 的α?Syn PFF 緩慢注射至模型組右側(cè)紋狀體內(nèi)（前囟前0.2 mm，旁開2.0 mm，縱深3.0 mm），對照組注射等體積0.01M PBS（pH 7.4）。術(shù)后飼養(yǎng)6 個月，行為學(xué)檢測小鼠運動能力差異，取腦及結(jié)腸組織進行檢測。

1.4 行為學(xué)訓(xùn)練及檢測造模前，小鼠進行3 次平衡桿、爬桿訓(xùn)練。造模6 個月后進行平衡桿、爬桿實驗及曠場實驗。平衡桿實驗：100 cm × 1 cm× 1 cm 平衡桿水平置于離地50 cm 處，將距兩端10 cm 處分別定為起、終點。記錄小鼠從起點到達終點的時間。爬桿實驗：100 cm × 1 cm × 1 cm 長桿垂直于地面，記錄小鼠從桿頂端起點至終點所用時間。曠場實驗：記錄小鼠在50 cm × 50 cm ×40 cm 曠場箱內(nèi)自由運動10 min 的運動軌跡及平均運動速度。

1.5 Western blot（WB）實驗方法［7］簡述如下：取小鼠黑質(zhì)及距肛門4 ～6 cm 處結(jié)腸，RIPA 裂解液冰浴裂解，12 000 轉(zhuǎn)離心獲取上清，BCA 法測定蛋白濃度，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 后孵育兔源TH 抗體（1∶10 000）、鼠源α?Syn 抗體（1∶1 000）、兔源D1DR 抗體（1∶2 000）、內(nèi)參β?actin（1∶10 000）4 ℃過夜，對應(yīng)源性熒光二抗（1∶10 000）室溫1 h，ODYSSEY 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃膜。利用Im?ageJ 軟件分析目的蛋白與內(nèi)參的光密度值比值，對目的蛋白的表達量進行半定量分析。

1.6 免疫組化（immunohistochemistry，IHC）及免疫熒光（immunofluorescence，IF）IHC：小鼠麻醉后，37 ℃預(yù)熱生理鹽水灌流心臟，沖凈血液后更換為預(yù)冷的4%多聚甲醛灌注固定。剝離鼠腦及結(jié)腸組織，后固定48 h 及蔗糖梯度脫水后進行冰凍切片，厚度20 μm。將組織切片置于0.3%過氧化氫30 min，用含0.3% Triton?X 100 的PBS 通透過夜，2%山羊血清封閉后，4 ℃孵育兔源D1DR抗體（1∶500）、兔源TH 抗體（1∶10 000）48 h，兔SPN 試劑盒識別一抗后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液顯色，脫水封片后于顯微鏡下觀察，以細胞質(zhì)著棕黃色為陽性細胞，隨機選擇5 個視野拍照，記錄陽性細胞數(shù)。IF：一抗孵育后，使用山羊抗兔Alexa?fluor 488（1∶2 000）室溫孵育1 h。用含DAPI 的抗熒光衰減封片劑封片，倒置熒光顯微鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法使用Image J 軟件進行圖像分析，利用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，t檢驗分析評估組間統(tǒng)計學(xué)差異，連續(xù)變量相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05 時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠PD 模型建立行為學(xué)結(jié)果顯示，與對照組相比，6 個月后模型組小鼠通過平衡桿及爬桿所需時間延長（P＜0.001，表1），曠場平均運動速度減慢（P＜0.001，表1），運動軌跡集中在曠場四周且明顯稀疏（圖1），表現(xiàn)其出現(xiàn)運動遲緩、探索行為減少等PD 典型癥狀。同時，IHC 結(jié)果顯示模型組小鼠黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元明顯減少（P＜0.01，圖2），提示紋狀體立體定位注射α?Syn PFF 構(gòu)建小鼠PD模型成功。

表1 小鼠行為學(xué)實驗結(jié)果Tab.1 Behavioral experimental results of mice x±s

圖1 小鼠曠場實驗運動軌跡Fig.1 Motion trail in open field test

2.2 異常增加的α?Syn下調(diào)小鼠黑質(zhì)D1DR表達WB 結(jié)果顯示，模型組小鼠黑質(zhì)中α?Syn 表達增加（P＜0.001，圖3A、C），D1DR 及TH 表達明顯低于對照組（P＜0.01，圖3A、B；P＜0.05，圖3A、D），同時IF 結(jié)果也表現(xiàn)為模型組D1DR 陽性神經(jīng)元減少，熒光強度減弱（P＜0.01，圖4），表明異常增加的α?Syn 可以下調(diào)黑質(zhì)D1DR 的表達。

2.3 結(jié)腸組織D1DR、TH 表達降低且與黑質(zhì)對應(yīng)表達改變呈正相關(guān)WB 顯示，模型組結(jié)腸中D1DR 及TH 的表達低于對照組（P＜0.01，圖5），且其相對表達量與黑質(zhì)中的相對表達量呈正相關(guān)（r=0.894 3、0.902 6，P＜0.05，圖7A、B）。此外，IHC 結(jié)果亦出現(xiàn)模型組D1DR 陽性細胞數(shù)減少（P＜0.05，圖6），與WB 結(jié)果一致。

3 討論

本研究通過紋狀體立體定位注射α?Syn PFF制備α?Syn 異常增加的小鼠PD 模型，通過WB、IHC及IF 等檢測手段發(fā)現(xiàn)PD 小鼠黑質(zhì)及結(jié)腸中D1DR及TH 表達出現(xiàn)平行下降，為結(jié)腸活檢應(yīng)用于評估早期PD 患者中樞神經(jīng)病理提供了實驗基礎(chǔ)。

圖2 小鼠黑質(zhì)TH（IHC）Fig.2 IHC results of TH in substantia nigra of mice

圖3 小鼠黑質(zhì)D1DR、α?Syn、TH 蛋白的表達Fig.3 Expression of D1DR，α?Syn and TH in substantia nigra of mice

圖4 小鼠黑質(zhì)D1DR（IF）Fig.4 IF results of D1DR in substantia nigra of mice

圖5 小鼠結(jié)腸D1DR、TH 蛋白表達Fig.5 Expression of D1DR，TH in the colon of mice

圖6 小鼠結(jié)腸D1DR（IHC）Fig.6 IHC results of D1DR in the colon of mice

PD 的典型臨床表現(xiàn)除常見的運動癥狀外，還伴有便秘、吞咽困難，睡眠異常，抑郁等非運動癥狀［8-9］。在出現(xiàn)運動癥狀之前，許多PD 患者常出現(xiàn)營養(yǎng)不良、便秘等消化道癥狀［10-11］。越來越多的證據(jù)表明，PD 的臨床診斷大多發(fā)生在疾病進展的較晚階段［12］，而其病理改變可能更早地起源于胃腸道，進而進展到大腦［13-14］。BRAAK 假說［15］認為，在PD 患者中，消化系統(tǒng)黏膜下神經(jīng)叢的α?Syn錯誤折疊和聚集可通過一系列連續(xù)的投射神經(jīng)元到達大腦。KIM 等［16］驗證了α?Syn 造成的病理改變可通過迷走神經(jīng)以固定的方式從胃腸道傳播到腹側(cè)中腦，選擇性地破壞黑質(zhì)致密部DA 能神經(jīng)元。在PD 中，基底神經(jīng)節(jié)回路中黑質(zhì)?紋狀體通路的退化［17］和多巴胺能信號的失衡導(dǎo)致患者出現(xiàn)運動障礙［18-19］。通過在大鼠中腦腹側(cè)部過表達人源α?Syn，ULUSOY 等［20］在節(jié)前迷走神經(jīng)軸突末梢及胃壁內(nèi)臟運動神經(jīng)末梢均探測到外源性α?Syn的存在，提示了PD 患者α?Syn 在腸神經(jīng)系統(tǒng)的沉積也可能經(jīng)迷走神經(jīng)來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)。因此，本研究推測，α?Syn 的異常增加與DA 能神經(jīng)元退化在中腦黑質(zhì)和結(jié)腸中存有潛在聯(lián)系。生理條件下，α?Syn 維護突觸完整性和穩(wěn)定性、參與調(diào)節(jié)DA的生物合成，對正常神經(jīng)活動具有重要作用［21］。而在病理情況下，α?Syn 可寡聚化為可溶性原纖維導(dǎo)致路易小體的形成［22］。已有研究證實，野生型非轉(zhuǎn)基因小鼠單側(cè)紋狀體內(nèi)接種合成的α?Syn 原纖維可導(dǎo)致類似PD 的路易小體出現(xiàn)［23］。

圖7 小鼠黑質(zhì)及結(jié)腸D1DR、TH 的相關(guān)性分析Fig.7 The relevance analysis of D1DR，TH in substantia nigra with colon of mice

本研究通過紋狀體立體定位注射α?Syn PFF制備小鼠PD 模型，通過行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)模型組小鼠平衡桿及爬桿所需的時間明顯延長，平均運動速度減慢，提示注射α?Syn PFF 的小鼠出現(xiàn)了明顯的運動障礙。WB 及IHC 檢測結(jié)果顯示黑質(zhì)TH 表達下降及陽性神經(jīng)元明顯減少，WB 及IF 結(jié)果顯示D1DR 表達下降及D1DR 陽性神經(jīng)元減少。上述結(jié)果表明，異常增加的α?Syn 可以導(dǎo)致DA 能神經(jīng)元變性并抑制D1DR 的表達。同時，本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠結(jié)腸中D1DR 及TH 均低于對照組小鼠，與其在黑質(zhì)中的表達改變呈正相關(guān)。提示α?Syn 的異常增加可能通過影響結(jié)腸的D1DR 及TH 的表達導(dǎo)致胃腸功能紊亂。

本研究采用小鼠紋狀體內(nèi)注射α?Syn PFF 構(gòu)建PD 模型能較好地模擬PD 患者的病理情況，對結(jié)腸組織相關(guān)分子表達的研究將有助于探討PD患者胃腸道癥狀發(fā)生的機制。但鑒于樣本量限制，未來將擴大動物模型樣本量來進行實驗分析，重點關(guān)注α?Syn是如何抑制D1DR表達的分子機制，進一步探討PD中運動癥狀與胃腸道癥狀的相互關(guān)系。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在紋狀體立體定位注射α?Syn PFF 制備的小鼠PD 模型中，黑質(zhì)及結(jié)腸D1DR、TH 均表達降低且存在平行的改變，該發(fā)現(xiàn)對研究PD 患者胃腸道癥狀的發(fā)生機制有一定的提示作用，為結(jié)腸活檢應(yīng)用于評估早期PD 患者中樞神經(jīng)病理提供了實驗基礎(chǔ)。