鐘引鳳，劉曉芳，劉 貝，黃云祥，何慶華，李燕萍，涂 追，劉 瓊，付金衡*

(南昌大學a.生命科學學院，江西 南昌 330031；b.中德聯合研究院，江西 南昌 330047；c.食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；d.基礎醫(yī)學院，江西 南昌 330031)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)是一種螺旋形、微嗜氧、革蘭氏陰性感染性病原體，主要寄生在在人體的胃黏膜上[1]。感染幽門螺桿菌會帶來各種腸胃道疾病，如胃炎、消化性潰瘍、胃癌等[2,4]，世界上一半的人口遭受了幽門螺桿菌的感染[1]。胃中的尿素酶早在20世紀就被發(fā)現，且尿素酶被證明具有很高的抗原性被認為是開發(fā)預防和治療性幽門螺桿菌感染疫苗的潛在抗原，有證據表明尿素酶是幽門螺桿菌感染患者抗體識別的主要靶點[3]。

目前，基于免疫尿素酶分析檢測幽門螺桿菌感染的大多是多克隆抗體[15]和單克隆抗體[16]、scFV[17]，但這些抗體存在穩(wěn)定性差、產量少等不足，使用具有分子量低、穩(wěn)定性好、親和力高、易于基因程改造等優(yōu)點的納米抗體檢測幽門螺桿菌鮮有報道[5-7]。近年來，納米抗體被廣泛地應用于食品安全檢測、醫(yī)學診斷及治療、藥物開發(fā)等各個領域[18-21]?，F階段，治療幽門螺桿菌感染的常規(guī)藥是抗生素，盡管在一些臨床實驗中，抗生素治療表現了積極的效率，但遇到復雜臨床病癥時的真實效率仍無法保證[8]。疫苗是防治幽門螺桿菌感染考慮的策略之一，但鑒于其易在人體內產生免疫耐受，限制了幽門螺桿菌疫苗的應用，同時不同的疫苗策略還會帶來安全性問題[9]。研究者們對納米抗體的深究，使其在疾病診斷及治療領域的應用迅速發(fā)展[10-12]。

本研究聚焦抗UreB納米抗體的應用，構建抗UreB納米抗體噬菌體免疫文庫，采用免疫親和淘選，從該文庫中獲得了抗幽門螺桿菌UreB納米抗體，通過基因工程技術獲得了原核表達的納米抗體，并進行了初步功能鑒定。本研究中淘選的抗幽門螺桿菌UreB納米抗體可以利用納米抗體的高特異性和高親和力，建立一系列簡單、便捷、成本低的檢測幽門螺桿菌感染的方法，達到早期預防和診斷的目的。同時也可以將抗幽門螺桿菌UreB納米抗體進行人源化改造，為以后用做抗體藥物治療幽門螺桿菌感染打下良好基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

幽門螺桿菌J99菌液由南昌大學基礎醫(yī)學院劉瓊講師惠贈；PCR引物由上海生工合成；EasyGeno快速重組克隆試劑盒購自天根生化科技有限公司；pET25b、噬菌粒載體pComb3XSS、輔助噬菌體M13KO7為實驗室保存。

1.2 主要儀器

穩(wěn)壓電泳儀(DYY-I Ⅲ)六一儀器廠；酶標儀Thermo公司；超聲破碎儀新芝生物科技股份有限公司；PCR儀器BIO-RAD。

1.3 方法

1.3.1 幽門螺桿菌UreB重組蛋白的表達與鑒定

(1)幽門螺桿菌UreB基因的擴增和TA克隆

根據NCBI上AY714224.1的UreB基因序列和pET25b載體設計引物：UreB-F1：5′-GGAATTCCAAAAAGATTAGCAGAAAAG-3′(EcoRI)

UreB-R1：5′-CCAAGCTTGGGAAAATGCTAAAGAGTTGCGC-3′(HindIII)。以幽門螺桿菌J99菌液為模板，PCR反應條件為94 ℃(預變性)：5 min，94 ℃(變性)：1 min，55 ℃(退火)：1 min，72 ℃(延伸)：2 min，35個循環(huán)，72 ℃：10 min。瓊脂糖凝膠電泳分析產物，根據Mighty TA-cloning Kit進行TA克隆，電轉至E.coliDH5α感受態(tài)中，菌落PCR驗證克隆并送至擎科生物技術有限公司測序。

(2)重組質粒的構建及表達

分別將UreB基因和pET25b載體用EcoRI和HindIII雙酶切酶連后電轉至E.coliDH5α感受態(tài)中，菌落PCR驗證克隆并測序。將序列正確的陽性克隆電轉至E.coliRosetta感受態(tài)細胞中，涂布在2×YT-amp平板中，取單個菌接于5 mL LB-amp液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r·min-1過夜培養(yǎng)按1%接種于50 mL LB-amp液體培養(yǎng)基中，220 r·min-137 ℃培養(yǎng)至OD600為0.4左右，加入0.2 mmol·L-1IPTG 25 ℃誘導表達4 h，收集菌體，超聲破碎后收集上清和沉淀，SDS-PAGE鑒定。

(3)重組蛋白的變性、純化及復性

收集目的蛋白包涵體沉淀，用包涵體洗滌液(50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，0.5% Triton X-100)洗3次，加入適量體積的變性液(50 mmol·L-1Tris-HCl，pH8.0，100 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1DTT，8 mol·L-1尿素)，4 ℃，水平搖床放1 h，離心取上清，Ni-柱純化，將含目的蛋白且純度較高的洗脫液，每間隔4 h加入等體積的包涵體復性液(50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol·L-1NaCl，1.5 mmol·L-1GSH，0.3 mmol·L-1GSSG，0.5 mol·L-1精氨酸)以逐步稀釋尿素濃度，再經10 kDa微量透析管透析,測蛋白濃度蛋白定量。

1.3.2 羊駝免疫及血清效價測定

將4×108cfu滅活的HpJ99菌與相同體積弗氏完全佐劑乳化后，對羊駝進行皮下多點注射免疫，每隔2周，取2×108cfu滅活的幽門螺桿菌J99菌與等體積弗氏不完全佐劑乳化進行加強免疫，取3次加強免疫的羊駝血測血清效價。方法如下：100 μL濃度為5 μg·mL-1重組蛋白UreB，于4 ℃冰箱中包被12 h；PBST溶液洗滌3次后，4%的脫脂牛奶于37 ℃中封閉1 h；PBST溶液洗滌3次后，梯度稀釋后的羊駝血清于37 ℃中結合30 min；PBST溶液洗滌3次后，加入100 μL 1/5000的HRP標記鼠抗羊駝的抗體稀釋液，于37 ℃孵育30 min；PBST溶液洗滌6次后，加入100 μL TMB單組份顯色液，于37 ℃中顯色10 min；最后加入2 moL·L-1H2SO4終止液，酶標儀測OD450值。

1.3.3 抗幽門螺桿菌納米抗體噬菌體展示文庫的構建

具體方法參考文獻[13]，簡單描述為：從羊駝血液中獲取總RNA，根據Thermo公司的cDNA反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，通過two-step nested PCR方法獲得VHH基因，第一步反應,使用alpVh-LD(5′-CTTGGTGGTCCTGGCTGC-3′)和CH2-R(5′-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3′)一對引物，擴增出約700 bp的VH域；第二步反應，使用VHH-1(5′-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3′)和VHH-2(5′-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3′)或VHH-3(5′-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3′)兩對引物PCR出約500 bp的VHH基因。分別用SfiI酶切VHH基因和噬菌粒載體pComb3XSS，酶連后轉化至E.coliTG1感受態(tài)里，過夜固體培養(yǎng)后，以1/20的感染復數感染M13KO7輔助噬菌體，建抗Hp UreB納米抗體的噬菌體文庫，并通過插入率和庫容及多樣性鑒定評估文庫質量。

1.3.4 抗Hp納米抗體噬菌體展示文庫的淘選

采用固相免疫親和淘選，以重組蛋白UreB為抗原，從建的納米抗體噬菌體庫中篩選出能特異性結合UreB的納米抗體。具體方法參照文獻[14]，按表1條件進行三輪篩選，每一輪篩選后，取10 μL洗脫物測滴度，剩余洗脫物擴增后用于下一輪的篩選。

表1 淘選條件

1.3.5 間接phage-ELISA鑒定陽性克隆

分別從第2、3輪洗脫物測滴度的平板上(選取菌落數100～300個的平板)，隨機挑取48個克隆子，進行單個噬菌體克隆的救援[14]，根據OD450樣本值/OD450陰性對照值≥2時，視為陽性克隆，并進行特異性驗證及測序。

1.3.6 抗重組幽門螺桿菌UreB納米抗體的原核表達

(1)表達載體pET25b(+)-HU2-9、pET25b(+)-HU2-36的構建

分別以pComb3XSS-HU2-9、pComb3XSS-HU2-36質粒為模板，根據EasyGeno快速重組克隆試劑盒說明書設計擴增VHH基因的F′(5′-AGCCGGCGATGGCCATGCAGGTGCAGCTCGTGGATGC-3′)和R′(5′-ATCTCGAGTGCGGCCGCCTGGCCGGCCTGGCCGTCTTG-3′)引物，PCR擴增出VHH基因，表達載體pET25b(+)進行NcoI和NotI雙酶切，按EasyGeno快速重組克隆試劑盒說明書配制連接體系，混合反應液置于50 ℃反應15 min，瞬時離心并置于冰上冷卻，鈣轉至Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞中，涂布于2×YT-amp平板篩選陽性克隆，隨機挑取克隆子進行菌落PCR驗證并測序。

(2)抗重組幽門螺桿菌UreB納米抗體誘導表達與純化

將陽性克隆培養(yǎng)至OD600約0.5時，在30 ℃，220 r·min-1，加入終濃度為0.1 mmol·L-1IPTG搖床培養(yǎng)6 h后，收集菌體，超聲破碎后將含有目的蛋白的上鎳柱純化，SDS-PAGE鑒定蛋白純度。

1.3.7 間接ELISA鑒定抗重組幽門螺桿菌UreB納米抗體結合Hp的活性

具體方法參考文獻[14]，簡單概括為包被3 μg·mL-1的幽門螺桿菌全菌蛋白，結合時加入不同濃度的納米抗體，測OD450，根據OD450樣本值/OD450空白對照值≥2時，即認為納米抗體在該濃度下具有結合幽門螺桿菌的能力。

1.3.8 抗重組幽門螺桿菌UreB納米抗體抑制尿素酶活性鑒定

具體方法參考文獻[4]，通過在一定時間內，測定CO2濃度的變化，評估納米抗體中和幽門螺桿菌尿素酶活性的能力，即體外培養(yǎng)幽門螺桿菌至109cfu，然后與不同濃度的納米抗體于4 ℃下孵育16 h，加入100 μL 500 mmol·L-1尿素和0.2 g·L-1的酚紅混合液于37℃下孵育3 h，在這3 h內，每30 min，測定OD550，通過公式計算抑制率。

2 結果與分析

2.1 幽門螺桿菌UreB重組蛋白的表達與鑒定

2.1.1 幽門螺桿菌UreB基因的擴增

利用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產物，凝膠成像系統顯示在大約1 700 bp左右有一條清晰的條帶，其大小與幽門螺桿菌UreB基因理論分子量大小(1 710 bp)相近，成功擴增到幽門螺桿菌UreB基因片段，具體見圖1。

M:DNA marker,1:PCR產物UreB。

2.1.2 幽門螺桿菌UreB蛋白表達及純化

重組pET25b-UreB質粒，電轉至E.coliRosetta感受態(tài)細胞中，0.2 mmol·L-1IPTG誘導表達純化后，SDS-PAGE電泳鑒定誘導后的表達情況，從圖2可得UreB基因在該原核表達系統中表達，UreB重組蛋白分子量大小約66 kDa與理論值相符，復性后獲得高純度的目的蛋白。

2.2 羊駝免疫后血清效價的測定

將滅活的幽門螺桿菌J99菌株免疫羊駝4次，分別取第2，3，4次免疫羊駝后的血清并以免疫之前的血清作為陰性對照，倍比稀釋免疫羊駝前后的血清，以重組蛋白UreB為抗原，間接ELISA法測效價如圖3所示。隨著免疫次數的增加免疫反應隨之增強，特異性的抗體增多，菌體展示文庫，有利于淘選出特異性好、親和力高的納米抗體。

M:蛋白marker；1～4:復性前用不同濃度咪唑洗脫的蛋白；5:復性后重組蛋白UreB。

K

2.3 抗幽門螺桿菌納米抗體噬菌體展示文庫的構建

采取羊駝血30 mL，提取總RNA，如圖4(a)所示，可清晰的看到總RNA的18S和28S兩條帶。兩步巢式PCR擴增VHH基因，第一步巢式PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定如圖4(b)所示，750 bp左右出現長鉸鏈重鏈抗體編碼的可變區(qū)基因。第二步反應以第一步回收純化后的產物作為模板進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物如圖4(c)所示。

(a):提取的總RNA,M:DNA marker DL2000,1:總RNA；(b):第一輪巢式PCR,M:DNA marker,1-2:兩對引物的PCR產物,目的條帶約為750 bp；(c):第二輪巢式PCR,M:DNA marker；1-2:兩對引物的PCR產物，目的條帶約為750 bp。

在450 bp左右出現與預期擴增的VHH片段大小相符的條帶，純化PCR產物將其與噬菌粒載體pComb3XSS分別進行SfiI酶切，T4 DNA酶連接后電轉至E.coliTG1感受態(tài)中，37 ℃固態(tài)過夜培養(yǎng)，隨機挑24個單菌落進行菌落PCR驗證，如圖5(a)所示，在650 bp左右有條帶，計算得VHH基因插入率為87.5%，將陽性克隆送測序，多序列比對結果如圖5(b)所示，21個陽性克隆的基因均為編碼VHH的基因序列抗體庫的有效庫容達到4.68×107cfu。

2.4 抗幽門螺桿菌納米抗體噬菌體展示文庫的淘選

以重組蛋白UreB為靶分子，經過3輪固相親和淘選，每輪以“吸附-洗滌-洗脫-擴增”為主要步驟，逐輪降低靶分子包被濃度、文庫投入量，增加洗滌次數來富集特異性結合UreB的納米抗體，結果如表2所示，噬菌體克隆得到有效富集。

表2 各輪淘選中結合UreB的噬菌體克隆的滴度和富集度

(a):菌落PCR,M:DNA marker；1-24:隨機挑選的菌落；(b):alignment的比對序列。

2.5 間接phage-ELISA鑒定陽性克隆

通過間接ELISA檢測從測洗脫噬菌體滴度的平板上隨機挑取的48個噬菌體克隆救援后的上清[14]，根據OD450樣本值/OD450陰性對照值≥2即為陽性噬菌體，選取吸光度較高的11個陽性噬菌體進行交叉實驗，結果如圖6所示11個陽性噬菌體特異性都較好。序列測定后，采用alignment軟件進行多序列對比分析，得到了6種不同的獨特納米抗體基因序列，序列分析發(fā)現HU2-9和HU2-36 CDR3區(qū)長度適中且無半胱氨酸易表達，故用這兩個納米抗體進行后續(xù)實驗。

2.6 納米抗體的原核表達

2.6.1 表達載體pET25b(+)-HU2-9、pET25b(+)-HU2-36的構建陽性克隆的菌落PCR鑒定結果如圖7所示，在750 bp處出現目的條帶，陽性克隆測序結果表明，表達載體pET25b(+)-HU2-9、pET25b(+)-HU2-36構建成功。

Phage Clones

M:DNA marker；12:HU2-9重組克?。?3-22:HU2-36重組克?。?3:陰性對照；24:空白對照。

2.6.2 納米抗體的表達與純化

將重組表達載體轉化至E.coliRosetta(DE3)感受態(tài)細胞，0.1 mmol·L-1IPTG誘導表達6 h，超聲破碎后收集上清，Ni柱純化后SDS-PAGE鑒定純化效果，結果如圖8表明，在20 kDa處有蛋白條帶，符合目的蛋白分子量大小，經BCA方法定量后，算出重組蛋白表達量分別為92和32 mg·L-1。

M:蛋白marker,1-3:分別為20 mmol·L-1咪唑、300 mmol·L-1咪唑、500 mmol·L-1咪唑下洗脫的HU2-9蛋白；4-6:分別為20 mmol·L-1咪唑、300 mmol·L-1咪唑、500 mmol·L-1咪唑下洗脫的HU2-36蛋白。

2.7 納米抗體HU2-9、HU2-36結合幽門螺桿菌的活性分析

間接phage-ELISA分析表達的納米抗體活性，以破碎的幽門螺桿菌全菌蛋白為檢測抗原，分別測定不同濃度的納米抗體HU2-9和HU2-36結合幽門螺桿菌的活性，根據OD450樣本值/OD450空白對照值≥2即認為具有結合幽門螺桿菌全菌蛋白的能力，結果如圖9表明，只有納米抗體HU2-9在濃度為112.5 μg·L-1時，才能與幽門螺桿菌全菌蛋白結合。

2.8 納米抗體HU2-9、HU2-36中和幽門螺桿菌尿素酶活性分析

不同濃度的納米抗體與109cfu幽門螺桿菌J99菌株孵育，通過檢測一定時間內，CO2濃度的變化，分析抗UreB納米抗體抑制尿素酶活性的影響，如圖10所示，當納米抗體濃度在30 μg·mL-1時，通過計算HU2-9、HU2-36抑制率分別為18.7%，15.6%，跟Leila Safaee Ardekani淘選出的納米抗體在30 μg·mL-1，抑制率為25%相比具有一定的差異[15]。

Nanobody Concention/(μg·mL-1)

Nanobody Concention/(μg·mL-1)

3 討論

本研究通過將滅活的HpJ99菌皮下多點注射免疫羊駝，經過4次免疫成功地構建抗UreB納米抗體噬菌體免疫文庫，利用固相免疫親和淘選，從文庫中成功得淘選出了6種不同序列的抗幽門螺桿菌UreB納米抗體。用基因工程技術成功構建了pET25b(+)原核表達載體，經金屬Ni螯合層析柱純化獲得了較高純度的可溶性重組蛋白。通過間接ELISA對納米抗體中和幽門螺桿菌尿素酶活性分析，發(fā)現納米抗體能夠一定程度地抑制幽門螺桿菌。本研究中淘選的抗幽門螺桿菌UreB納米抗體可以利用納米抗體的高特異性和高親和力，建立一系列簡單、便捷、成本低的幽門螺桿菌感染的檢測方法，達到早期預防和診斷的目的。同時也可以將抗幽門螺桿菌UreB納米抗體進行人源化改造，為以后用做抗體藥物治療幽門螺桿菌感染打下良好基礎。