(1. 南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 湖南省衡陽市 421001；2.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院，湖南省衡陽市421001；3.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北省武漢市 430023)

肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae,Mp)可引起兒童或青少年急性呼吸道感染，常伴間質(zhì)性肺炎。少數(shù)患者因Mp過度免疫應(yīng)答引發(fā)嚴(yán)重肺損傷，如肺膿腫、壞死性肺炎、急性呼吸窘迫綜合征等，嚴(yán)重者可危及生命[1-2]。此外，慢性持續(xù)性Mp感染可誘發(fā)哮喘[3-4]，腦膜腦炎[5]等并發(fā)癥，其誘發(fā)機(jī)制尚在研究中[6]。近年來，兒童難治性支原體肺炎(持續(xù)性Mp感染)病例日趨增多，且死亡病例逐年增加[7]。在中國約超過70% Mp臨床分離株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥[8]，加大了Mp感染患者的治療難度[9]。因此，研究新型抗Mp感染的有效藥物具有重要意義。

臨床應(yīng)用的阿法替尼(Afatinib,BIBW-2992，2013年上市)屬于不可逆ErbB家族阻滯劑[10]，是一種酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI)，可靶向抑制肺癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤的發(fā)展[11]。此外，阿法替尼與DMSO聯(lián)用可有效殺滅革蘭陰性菌如大腸桿菌，并可對細(xì)菌胞外聚合物基質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾，從而顯著降低其生物膜的形成[12]。本研究擬通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)評價(jià)阿法替尼抗Mp感染的效果。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

肺炎支原體Ⅰ型標(biāo)準(zhǔn)株M129(ATCC29342)由昆明醫(yī)科大學(xué)饋贈(zèng)；阿法替尼(Afatinib，CAS 850140-72-6)(圖1)由武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院提供，純度≥98.0%；活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；細(xì)胞因子ELISA試劑盒購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。

圖1 阿法替尼化學(xué)結(jié)構(gòu)式(C24H25ClFN5O3)

1.2 Mp培養(yǎng)

將Mp M129株接種到PPLO液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃(5%CO2,95%N2)培養(yǎng)3～5天，10 000 ×g 4 ℃離心20 min，PBS重懸菌體沉淀，取100 μL菌液涂布于PPLO固體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧(5%CO2,95%N2)培養(yǎng)7天，顯微計(jì)數(shù)并計(jì)算Mp數(shù)量。將Mp菌懸液分別調(diào)至5.0×108CFU/L與3.5×1011CFU/L，備用。

1.3 阿法替尼藥物溶解及溶劑對照的準(zhǔn)備

稱取50 mg阿法替尼溶于45 mL無菌去離子水中，以500 μL的1 kg/L檸檬酸溶液助溶，調(diào)pH至6.5后定容50 mL，制成1 g/L的阿法替尼溶液，0.22 μm濾器除菌備用。依照上述方法，不含阿法替尼的檸檬酸溶液作為溶劑對照組。

1.4 阿法替尼體外抗Mp最小抑菌質(zhì)量濃度和顏色變化單位的測定

取28支預(yù)先加入1.8 mL PPLO液體培養(yǎng)基的試管，每組7支試管，將其分為PBS組、Mp組、Afatinib組和溶劑對照組。PBS組預(yù)先加入1.8 mL PPLO液體培養(yǎng)基；Mp組于該組第一支試管中加入0.2 mL的5.0×108CFU/L Mp菌液，吸吹混勻后，吸出0.2 mL加入第二管，依次類推10倍梯度稀釋至第七支試管(104～1010CCU/L的Mp菌液)，吸吹混勻后棄去0.2 mL，最后在每支試管中均加入0.2 mL滅菌PBS；Afatinib組方法同Mp組，最后在每支試管中均加入0.2 mL Afatinib溶液；溶劑對照組方法同Mp組，最后在每支試管中均加入0.2 mL溶劑對照溶液。觀察培養(yǎng)7天和14天后PPLO培養(yǎng)基顏色變化情況。

微量肉湯稀釋法[13]測定阿法替尼抗肺炎支原體的最小抑菌質(zhì)量濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)，連續(xù)觀察7天，以培養(yǎng)基顏色不變的最高稀釋度質(zhì)量濃度為MIC，平行測定3次。

1.5 肺炎支原體感染小鼠模型的建立和分組

本研究經(jīng)南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。將32只SPF級6周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白組和模型組兩組，每組16只。溫度24 ℃、濕度45%、循環(huán)光照(明暗各12 h)環(huán)境飼養(yǎng)，自由攝食飲水，適應(yīng)環(huán)境1周。向空白組小鼠鼻內(nèi)滴入30 μL PBS，向模型組小鼠鼻內(nèi)滴入等量的3.5×1011CFU/L Mp懸液構(gòu)建Mp感染模型(Mp數(shù)量約1.0×107個(gè))。隨后將空白組小鼠分為正常組和藥物對照組，每組8只。將模型組分為Mp組與Afatinib組，每組8只。正常組與Mp組于次日用PBS溶液霧化處理，Afatini組和藥物對照組則用1 g/L阿法替尼霧化給藥。霧化條件為0.2 mL/min，15 mim/次，2次/天，共2天。

1.6 肺組織中Mp活菌計(jì)數(shù)

于Mp感染后第3天，取100 μL小鼠肺勻漿上清涂布于PPLO固體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧(5%CO2，95%N2)培養(yǎng)7天，顯微計(jì)數(shù)并計(jì)算Mp數(shù)量。

1.7 血細(xì)胞計(jì)數(shù)及炎癥指數(shù)計(jì)算

內(nèi)眥靜脈采集Mp感染后第3天的小鼠血液標(biāo)本，抗凝管低溫保存，全血細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞總數(shù)(white blood cells，WBC)、中性粒細(xì)胞數(shù)(neutrophile granulocyte，NEUT)、淋巴細(xì)胞數(shù)(lymphocyte，LYMPH)、單核細(xì)胞數(shù)(mononuclear leucocyte，MONO)，分析中性粒細(xì)胞數(shù)/淋巴細(xì)胞數(shù)(NLR)和單核細(xì)胞數(shù)/淋巴細(xì)胞數(shù)(MLR)。NLR和MLR升高，對CAP具有高診斷價(jià)值，且與CAP嚴(yán)重程度有顯著相關(guān)性[14]。

1.8 HE病理切片

取福爾馬林固定后的Mp感染第3天小鼠肺組織，石蠟包埋，切成<5 μm薄片，蘇木精伊紅染色，觀察肺組織切片炎性細(xì)胞浸潤情況。

1.9 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的檢測

取Mp感染第3天小鼠1 mL肺組織勻漿分離細(xì)胞，參照ROS檢測試劑盒方法測定細(xì)胞的ROS水平。以熒光強(qiáng)度作為ROS水平高低評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1.10 炎癥因子的測定

肺勻漿上清炎性細(xì)胞腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的測定參照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測定并計(jì)算各組細(xì)胞因子質(zhì)量濃度。

1.11 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 體外顏色變化單位與最小抑菌質(zhì)量濃度結(jié)果

阿法替尼體外抗Mp結(jié)果顯示Afatinib及PBS組培養(yǎng)14天后仍無顏色變化，而Mp組與溶劑對照組培養(yǎng)7天顏色變化單位為107CCU/L，培養(yǎng)14天為1010CCU/L。通過微量肉湯稀釋法測定阿法替尼抗肺炎支原體的MIC為16 mg/L。

2.2 各組小鼠肺組織中Mp活菌計(jì)數(shù)比較

正常組及藥物對照組無Mp菌落，Afatinib組Mp數(shù)量較Mp組明顯降低(P<0.05；圖2)。

圖2 各組小鼠肺組織中Mp活菌計(jì)數(shù)的比較

2.3 各組小鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)及炎癥指數(shù)比較

小鼠血液中血細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，Mp組的白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)均高于Afatinib組(P<0.05；表1)，藥物對照組白細(xì)胞總數(shù)低于正常組。炎癥相關(guān)指數(shù)結(jié)果顯示Afatinib組NLR、MLR低于Mp組(P<0.05；表2)。

表1 各組小鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 單位：×109個(gè)/L

表2 各組小鼠炎癥指數(shù)比較

2.4 各組小鼠肺組織病理變化

正常組小鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，肺泡較完整，未見水腫及炎癥細(xì)胞浸潤等。Mp組可見嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，肺泡間隔增厚，且血管及支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤。Afatinib組肺泡間隔寬度、血管及支氣管周圍水腫程度及炎癥較Mp組明顯下降，藥物對照組肺組織可見輕微炎癥(圖3)。

圖3 各組小鼠肺組織切片HE染色的比較

2.5 各組小鼠肺組織細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平變化

DCFH-DA熒光探針法測定Afatinib組ROS水平較Mp組降低(P<0.05；圖4)。

圖4 各組小鼠肺組織胞內(nèi)ROS水平的比較

2.6 各組小鼠炎癥因子含量的變化

Afatinib組的TNF-α含量較Mp組降低(P<0.05)，而IL-1β及IL-6含量差異無顯著性(圖5)。

圖5 各組小鼠肺勻漿中細(xì)胞因子含量的比較

3 討 論

Mp是引起社區(qū)獲得性肺炎的主要病原體之一，隨著Mp對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥率的日趨增加使其感染的臨床治療難度加大[15]，同時(shí)耐大環(huán)內(nèi)酯類Mp感染引起的肺外并發(fā)癥發(fā)生率增高[16]，且耐大環(huán)內(nèi)酯類Mp引起的難治性肺炎死亡率逐年增高。目前尚無可用疫苗。因此，抗Mp感染的藥物研究具有重要意義。

阿法替尼是臨床上的一種抗腫瘤藥物，但其抗菌抗感染研究非常少。文獻(xiàn)[12]報(bào)道阿法替尼與DMSO聯(lián)用可有效殺滅銅綠假單胞菌及鼠傷寒桿菌，而其抗菌機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。TKI依魯替尼可通過抑制病原菌侵入胞內(nèi)并降低細(xì)菌在胞內(nèi)的增殖能力，從而增加宿主細(xì)胞的存活率[17]，依魯替尼還能使結(jié)核分枝桿菌難以在病變部位M1型巨噬細(xì)胞中寄居，從而使感染部位難以形成穩(wěn)定的肉芽腫結(jié)構(gòu)[18]，推測TKI的殺菌作用可能與其抑制酪氨酸激酶有關(guān)，使細(xì)菌代謝異常，進(jìn)而抑制細(xì)菌的增殖。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[19]，Mp糖脂與動(dòng)物組織化合物具有同源性，是引起宿主細(xì)胞自身免疫疾病重要原因，而布魯頓酪氨酸激酶(bruton tyrosine kinase,Btk)缺陷小鼠對Mp糖脂類抗原無免疫反應(yīng)?；谏鲜鲅芯浚疚奶骄苛死野彼峒っ敢种苿┌⒎ㄌ婺釋p的抑制作用及抗感染效果。

本文通過顏色變化單位及最小抑菌質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)評價(jià)阿法替尼體外抑菌效果，構(gòu)建小鼠Mp感染模型，檢測小鼠肺組織勻漿中Mp活菌數(shù)量，表明阿法替尼亦具有體內(nèi)抑制Mp增殖的效果。阿法替尼的體內(nèi)外抗菌、抗感染機(jī)制尚待研究。本研究通過血液學(xué)常數(shù)、炎癥指標(biāo)、肺組織病理切片評價(jià)阿法替尼體內(nèi)抗炎效果，結(jié)果顯示，阿法替尼治療后使外周血中WBC及其炎癥指標(biāo)NLR、MLR降低，且肺部病理切片可見炎癥明顯減輕。NLR[20]、MLR[14]可間接反映Mp感染導(dǎo)致的間質(zhì)性肺炎的感染程度；HE病理切片反映了肺部炎細(xì)胞浸潤及肺組織病變程度，表明阿法替尼可有效抑制肺炎支原體感染后引起的炎癥反應(yīng)。

ROS是包括超氧陰離子、過氧化物和自由基等的活性含氧分子，機(jī)體代謝異常時(shí)其含量升高，損傷細(xì)胞。據(jù)文獻(xiàn)[21]報(bào)道，Mp感染可引起肺組織細(xì)胞中ROS水平升高，導(dǎo)致大量肺上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而引起肺組織炎性損傷。Mp自身具有特殊的ROS耐受機(jī)制，因此ROS對Mp影響較小[22]。本研究對阿法替尼抑炎作用機(jī)制進(jìn)行了初步探索，結(jié)果顯示其氧化介質(zhì)ROS顯著降低。阿法替尼可通過降低肺組織中ROS水平而抑制ROS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，可能是其抗炎機(jī)制之一。阿法替尼可有效降低炎癥因子TNF-α水平，炎癥因子TNF-α含量對炎癥及其后續(xù)抗炎機(jī)制的研究有重要意義，與Al-Harbi NO等[23]的研究結(jié)果類似，該研究表明TKI依魯替尼可通過降低SOD氧化應(yīng)激及炎癥因子TNF-α減輕小鼠銀屑病樣炎癥，此外，TKI也可作用于酪氨酸激酶介導(dǎo)的炎癥通路[24]，如MAPK、PI3K和JAK-STAT等，從而調(diào)節(jié)炎癥因子水平。由此可見，在未來實(shí)踐中，可基于以上炎癥通路，對阿法替尼的抗炎機(jī)制做進(jìn)一步深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)阿法替尼能有效減輕Mp感染引起的炎癥，但藥物對照組的小鼠肺部有少許炎癥細(xì)胞，本文研究與文獻(xiàn)報(bào)道一致，TKI可抑制酪氨酸激酶作用的哮喘氣道炎癥[25]，但缺乏酪氨酸激酶會(huì)激活NLRP3炎癥小體[26]，酪氨酸激酶在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)有重要意義。因此，阿法替尼及其他TKI作為抗感染藥物需慎重考慮使用劑量及使用條件。

綜上所述，本研究基于體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明了阿法替尼具有抗Mp感染的效果，但其劑量與治療效果、安全性仍需進(jìn)一步研究，其抑制Mp增殖及其抗炎機(jī)制亦需深入研究。