張東東 常延河 郝福榮 任燕

煙霧吸入性損傷是指熱力、煙霧引起的呼吸道以至肺實質(zhì)的損害，為致死的最主要原因之一[1]。角質(zhì)細胞生長因子(Keratinocyte growth factor-2, KGF-2)為成纖維細胞生長因子(FGF)家族成員，主要表達于上皮細胞[2-3]。KGF-2主要在肺中表達，且它對組織和器官有非特異性作用[2]。KGF-2信號通路通過FGF受體(FGFR)FGFR-2Ⅲb控制內(nèi)源性遠端肺泡祖細胞的存活和增殖，這對肺的發(fā)育至關(guān)重要[4]。外源性KGF-2的灌注可抑制上皮細胞DNA損傷、凋亡和誘導肺纖維化程度，提示KGF-2可能是治療肺泡上皮損傷的一種新的候選藥物[5-7]。Bcl-2、SPA和VEGF都位于肺的上皮組織，都能促進肺損傷后的修復。本研究初步證明霧化吸入rhKGF-2對煙霧所導致的兔肺損傷，具有改善作用，可以提高兔肺組織的氧合作用，促進肺組織中相關(guān)修復基因的表達，減輕肺部損傷，改善通氣及肺功能。

資料與方法

一、實驗材料與試劑

實驗動物：取3個月大小的新西蘭大白兔40只，體重2.30±0.20kg，均為雄性，由河北省實驗動物中心提供，動物合格證號：809093。放置在實驗室飼養(yǎng)一星期。

主要試劑與儀器：PBS粉劑(Gibco)；KGF-2(新能源公司)；小兒氧氣霧化吸入器(日照康旭醫(yī)療設(shè)備工程有限公司)等。

二、實驗方法

1 實驗分組

將40只兔煙霧吸入性損傷模型，具體方法參照文獻[8]，然后將其分為4組，每組10只，PBS 組：煙霧肺損傷模型后，使用霧化器，每日霧化吸入PBS 液 5mL，一次/d，每次30min，連續(xù)4d；1mg/kg rh KGF-2 組：煙霧肺損傷模型后，使用霧化器，每日霧化吸入rh KGF-2(1mg/kg 加入5mL PBS 液)，一次/d，每次30min，連續(xù)4d；3mg/kg rh KGF-2 組：煙霧肺損傷模型后，使用霧化器，每日霧化吸入 rh KGF-2(3mg/kg 加入 5mL PBS 液)，一次/d，每次30min，連續(xù)4d；5mg/kg rhKGF-2 組：煙霧肺損傷模型后，使用霧化器，每日霧化吸入 rhKGF-2(5mg/kg 加入5mL PBS 液)，一次/d，每次30min，連續(xù)4d。

2 血氣分析檢測

在進行藥物處理4天后，由兔耳中央動脈處抽取動脈血，行血氣分析檢查。

3 肺組織HE染色

在進行藥物處理4天后，取不同組兔的肺部組織進行HE染色，制作切片，觀察肺組織結(jié)構(gòu)的變化。HE染色的具體步驟參考文獻[8]。

4 RT-PCR檢測Bcl-2、SP-A及 VEGF mRNA表達

每組動物均于治療4d后，各取 10 只行動脈血氣分析后，將其處死，收集肺組織標本，提取total RNA，進行反轉(zhuǎn)錄，獲得CDNA文庫，最終進行RT- PCR 檢測肺組織中 Bcl-2、肺表面活性蛋白 A(Alterations of surfactant protein A，SP-A)及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)m RNA 水平，具體實驗操作及引物設(shè)計參照文獻[8]。

5 免疫印跡檢測Bcl-2、SP-A及 VEGF 的蛋白表達

收集不同組的兔肺組織，加入適量RIPA細胞裂解液，提取各組的蛋白。配制10% SDS- PAGE，每孔加入30μg蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h， TBST稀釋一抗(1 ∶1 000稀釋)，4 ℃過夜；加入羊抗兔二抗(1 ∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h；ECL發(fā)光：實驗重復3次。主要抗體有Anti-Bcl-2(1 ∶2 000)，anti-SP-A(1 ∶1 000)，anti-VEGF(1 ∶1 000)，anti-β-actin(1 ∶1 000)，上述抗體購自美國CST公司。

三、數(shù)據(jù)統(tǒng)計

結(jié) 果

一、rhKGF-2對煙霧吸入性肺損傷兔 PaO2、 PaCO2的影響

rhKGF-2霧化吸入對傷后動物 PaO2、 PaCO2有影響。與PBS 組比較，隨著rhKGF-2的劑量的增加， PaO2也是逐漸升高且變化顯著(P<0.05)， 5mg/kg 組PaO2升高最為明顯(P<0.01)；與PBS組相比，當藥物劑量為1mg/kg 時，兔子PaCO2有降低的趨勢，隨著rhKGF-2劑量的增加，PaCO2也是升高，以rhKGF-2 劑量為5mg/kg 組，對 PaCO2的影響最明顯。具體結(jié)果(見表1)。

表1 肺損傷兔吸入不同劑量的KGF-2后PaO2、 PaCO2的變化

二、藥物rhKGF-2對構(gòu)建成功的損傷兔肺組織修復的病理切片結(jié)果

在PBS組中，兔的肺泡腔內(nèi)均可見程度不等的炎性表現(xiàn)，部分肺泡腔囊狀擴張或萎陷，肺泡腔內(nèi)及間質(zhì)內(nèi)大量中性粒細胞浸潤伴膿腫形成，肺泡腔內(nèi)含大量滲出液及出血，肺泡間隔增厚，肺透明膜形成，部分肺泡萎陷,但隨著rhKGF-2藥物的處理，肺部組織的癥狀有好轉(zhuǎn)，肺組織炎癥反應(yīng)均明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，肺泡間隔變薄，少許肺泡腔內(nèi)有紅細胞滲出，大部分肺泡腔未見滲出液，局部肺泡囊狀擴張，且隨著藥物劑量的增加，肺部組織修復的效果越好,尤其當藥物為5 mg/kg時，其肺部組織差不多恢復到正常(見圖1A-E)。

圖1 不同劑量的rhKGF-2對損傷性兔肺組織治療4天后的病理結(jié)果

三、 rhKGF-2對煙霧損傷兔肺組織中相關(guān)基因mRNA表達的影響

結(jié)果顯示，霧化吸入KGF-2對吸入性損傷兔肺組織中相關(guān)基因mRNA表達促進作用。與PBS組比較，隨著KGF-2劑量的增加，Bcl-2、SP-A 及 VEGF表達也逐漸增高，說明KGF-2促進了Bcl-2、SP-A 及 VEGF mRNA 的表達(見圖2)。

圖2 不同劑量的rhKGF-2對損傷性兔肺組織中Bcl-2、SP-A及 VEGF mRNA表達的影響

四、rhKGF-2對煙霧的損傷兔肺組織中相關(guān)基因蛋白表達的影響

結(jié)果顯示，與PBS組相比，Bcl-2、SP-A 及 VEGF 蛋白的表達均隨著劑量的增加而增長(P<0.05)，當藥物濃度為1mg/kg，Blc-2與VEGF的蛋白表達就有明顯增加(P<0.05)，當藥物濃度為3mg/kg時，Blc-2與VEGF的蛋白表達增加非常顯著(P<0.001)，比SP-A增加要顯著(P<0.01)；當藥物濃度為5mg/kg時，Bcl-2、SP-A 及 VEGF 蛋白的表達變化最為顯著(P<0.001)(見圖3)。

圖3 不同劑量的rhKGF-2對損傷性兔肺組織中Bcl-2、SP-A及 VEGF 蛋白表達的影響

討 論

煙霧吸入性肺損傷發(fā)生，主要是由煙霧的熱力及煙霧中的有毒氣體的吸入，而導致的呼吸道損傷，嚴重者會導致肺的損傷，最終會導致肺部及呼吸道的呼吸困難，影響人體內(nèi)的O2分壓及CO2分壓的變化[9-10]。本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著藥物吸入劑量的增加，其PaO2、PaCO2是逐漸升高的，與之前研究報道的結(jié)論具有一致性[11]。霧化吸入KGF-2 能夠改善肺部氣體交換能力，使肺損傷得到一定的修復。KGF-2主要在肺中表達，但也廣泛表達于其他具有多種生物活性的組織，包括血管生成、有絲分裂或細胞分化和遷移[12-14]。有證據(jù)表明KGF預處理對高氧誘導ALI的保護作用[15]。Jun She[16]的研究表明用KGF治療供體肺，通過改善表面活性劑及其穩(wěn)態(tài)，減少了移植后肺泡內(nèi)水腫形成，KGF在小血管中誘導新生血管形成，維持了毛細血管單層的屏障功能。

Bcl-2是多基因家族的一個成員，在決定細胞生死方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[17]。Bcl-2在內(nèi)分泌腺中表達失調(diào)，似乎有助于器官的腫瘤轉(zhuǎn)化，Bcl-2蛋白是一種強細胞凋亡抑制因子，在人上皮細胞的胚胎組織和基底細胞中表達，在正常生長調(diào)控和分化中發(fā)揮作用，且在多種細胞類型和多種刺激下均可發(fā)揮作用。我們的研究表明霧化吸入 KGF-2 能夠上調(diào)煙霧吸入性損傷兔肺臟 Bcl-2的mRNA及蛋白的表達，且隨著藥物的濃度的增加，表達量也在逐漸的增加，當藥物劑量為5mg/kg時，Bcl-2表達量上調(diào)最顯著。

SP-A和SP-D是肺表面活性物質(zhì)中最豐富的蛋白成分，其主要功能是通過識別碳水化合物域或C型凝集素域與各種病原體和過敏原表面的一系列碳水化合物結(jié)構(gòu)結(jié)合，可增強多種病原體對肺泡巨噬細胞的附著，促進吞噬作用。體外研究表明，在肺內(nèi)，SP-A與肺泡巨噬細胞相互作用，通過產(chǎn)生細胞因子、趨化因子和一氧化氮(NO)，調(diào)節(jié)肺防御系統(tǒng)，對肺上皮細胞具有保護作用[18-19]。而本研究中霧化吸入KGF-2 能夠增加損傷兔肺臟中 SP-A的mRNA及蛋白的表達，且隨著藥物濃度的不同，其對肺修復的效果也不同，以 5mg/kg霧化吸入KGF-2組，上調(diào) SP-A表達作用最明顯。

VEGF是內(nèi)皮細胞存活所必需的營養(yǎng)因子，在肺內(nèi)大量表達，慢性阻斷VEGF受體，可誘導肺泡細胞凋亡和肺損傷，VEGF信號抑制可降低發(fā)展中肺的肺泡和血管生長，提示VEGF信號抑制可導致支氣管肺發(fā)育不良，肺生長減慢[20]。本研究重復研究中發(fā)現(xiàn)KGF-2促進VEGF的mRNA及蛋白的表達，從而對吸入性損傷肺組織的結(jié)構(gòu)與功能具有一定的修復作用。

本研究在進行血氣分析后，處死的動物，取其肺部組織，提取蛋白，進行western blot檢測，測定其蛋白的表達，結(jié)果顯示，霧化吸入KGF-2對吸入性損傷兔肺組織中相關(guān)蛋白表達有促進作用。從電泳條帶可以看出，與對照組相比，PBS組動物肺組織中Bcl-2、SP-A 及 VEGF 的蛋白表達并無變化，條帶灰度無差別，說明他們蛋白的表達并無變化(P>0.05)；而在KGF-2藥物治療組中，發(fā)現(xiàn)隨著藥物劑量的增加，Bcl-2、SP-A 及 VEGF條帶的灰度也是在慢慢增加的，說明KGF-2促進了Bcl-2、SP-A 及 VEGF mRNA 的表達。與PBS組相比，Bcl-2、SP-A 及 VEGF 蛋白的表達量都有明顯的增加。

綜上所述，霧化吸入rhKGF-2對重度煙霧吸入性損傷兔肺組織的具有修復作用，且可能是通過某種途徑來促進Bcl-2、SP-A 和VEGF的表達，提高對肺損傷組織的保護作用。