虞忻 吳海燕 趙靜 張建平

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染的慢性呼吸系統(tǒng)傳染病，其中以肺結(jié)核為最常見，并嚴(yán)重威脅人類健康和生命安全。我國的肺結(jié)核發(fā)病率及死亡率位居所有傳染病首位，為全球第2位[1]。參照我國制定的“到2030年前肺結(jié)核發(fā)病率下降80%、病死率下降95%”的十三五結(jié)核病防治目標(biāo)[2]，以及當(dāng)前耐藥肺結(jié)核發(fā)病率逐年升高的情況[1]，同時廣泛耐藥結(jié)核也呈逐年上升趨勢，所以肺結(jié)核的防治已成為當(dāng)務(wù)之急，也是我國結(jié)核病防治的重要任務(wù)。

近年來，分子生物學(xué)檢測技術(shù)日趨成熟，給結(jié)核病的早期診斷開辟了新篇章。其中由美國Cepheid公司研發(fā)生產(chǎn)的GeneXpert MTB/RIF技術(shù)能2 h內(nèi)快速檢測MTB和利福平耐藥的全自動分子生物學(xué)檢測方法[3]。以往的檢測手段如痰涂片抗酸染色敏感度低、無法做菌種鑒定[4]；結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)需4～6周報(bào)告結(jié)果，無法滿足肺結(jié)核及耐藥結(jié)核病早診斷、早治療的要求，不利于結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的早期控制而導(dǎo)致結(jié)核播散甚至影響預(yù)后。所以在2010年，WHO正式批準(zhǔn)了GeneXpert MTB/RIF檢測方法的推廣應(yīng)用，并受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。有資料表明，70%左右的肺結(jié)核患者痰涂片抗酸染色陰性，病原學(xué)陽性率較低，同時部分患者難以咳出痰，肺結(jié)核早期診斷從而被延誤[5]。故臨床中進(jìn)行電子支氣管鏡灌洗液(BALF)病原學(xué)檢測，能有效提高結(jié)核分枝桿菌檢出率，對肺結(jié)核特別是菌陰肺結(jié)核的早期診斷有很大的幫助[6]。本研究對158例臨床診斷肺結(jié)核患者進(jìn)行回顧性分析，旨在探討支氣管肺泡灌洗液GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert法”)檢測對肺結(jié)核早期診斷的價值。

資料與方法

一、研究對象

選擇2017年9月～2018年9月蘇州大學(xué)附屬傳染病醫(yī)院肺科收治的臨床診斷肺結(jié)核的158例患者進(jìn)行回顧性研究，其中男112例，女46例；年齡14～81歲，平均(35.40±20.51)歲。入選患者均符合《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[7]標(biāo)準(zhǔn)，同時排除并發(fā)COPD、自身免疫系統(tǒng)疾病等患者，以及有氣管鏡檢查禁忌者，如嚴(yán)重心肺功能不全、嚴(yán)重心律失常、1周內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重大咯血等患者。對158例入組肺結(jié)核患者分別進(jìn)行痰液Xpert及BALF的直接涂片抗酸染色法、Xpert、熒光定量PCR檢測及BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960培養(yǎng)”)等四項(xiàng)檢測。以上所有研究方案均獲得蘇州大學(xué)附屬傳染病醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并同時取得研究對象知情同意。

二、研究方法

1 BALF采集

患者術(shù)前均完善血常規(guī)、凝血功能、心電圖，同時詢問有無高血壓、糖尿病、心律失常、支氣管哮喘、藥物過敏等病史，如有高血壓病史需術(shù)前服用降壓藥，有無服用抗凝藥物及抗血小板凝集等藥物的病史，如服用需停用3 d。術(shù)前禁食禁水4 h?；颊咝g(shù)前2%利多卡因會厭局麻后15分鐘，平仰臥，使用Olympus BF260或Olympus BF290電子支氣管鏡由口腔進(jìn)入，使用2%利多卡因局麻雙側(cè)主氣道，觀察顯示屏以完成采集操作。根據(jù)影像學(xué)改變及電子氣管鏡下表現(xiàn)，在病變部位予以刷檢、取活檢組織后，在病變部位段及以下支氣管灌入生理鹽水80～100 mL，負(fù)壓吸引回收支氣管肺泡灌洗液，送檢涂片抗酸染色、熒光定量PCR、Xpert MTB/RIF、MGIT 960液體培養(yǎng)等檢測。

2 痰標(biāo)本采集

患者深呼吸后咳出的痰液，痰標(biāo)本由檢驗(yàn)人員或經(jīng)培訓(xùn)合格的專人驗(yàn)收，留取痰液容器為國際通用的無菌螺旋痰瓶。患者深咳后產(chǎn)生的痰標(biāo)本應(yīng)由檢查員或訓(xùn)練有素的專業(yè)人員檢查并接受，保存痰液容器應(yīng)為無菌螺旋痰瓶并為國際認(rèn)可。

3 直接涂片抗酸染色法

根據(jù)《中國結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南(2008年版)》[8]進(jìn)行檢驗(yàn)操作并報(bào)告抗酸染色鏡檢結(jié)果分級[9]。

4 熒光定量PCR檢測

① 將同樣體積液化液加入痰標(biāo)本中并渦旋混合，取1 mL放入離心管以離心5 分鐘，除去上清液；② 將1 mL0.9%NS加入離心管中，渦旋振蕩混合后再次離心，棄上清；③ 將60μl核酸提取液加入離心管中，并渦旋振蕩混合，隨后使用晶芯ExtractorTM 36核酸快速提取儀，振蕩5 分鐘，置于95 ℃水浴中5 min，離心1 min獲得核酸；④ 取2μl擴(kuò)增檢測出結(jié)果。

5 MGIT 960培養(yǎng)

通過連續(xù)測定培養(yǎng)管中熒光強(qiáng)度，來測定結(jié)核分枝桿菌的生長狀態(tài)，并自動打印出結(jié)果。在50毫升離心管中加入痰液1～2mL，加入4%氫氧化納震蕩混勻，靜置半小時，離心去上清留沉淀。標(biāo)本接種：① 標(biāo)本接種前,在培養(yǎng)管中先加入營養(yǎng)添加劑(OADC)和雜菌抑制劑(PANTA)混合添加劑0.8mL；② 抽取0.5mL已處理樣本注入MGIT培養(yǎng)管中；③ 將接種好的MGIT培養(yǎng)管放入BACTEC MGIT-960 Tb中培養(yǎng)。

6 Xpert MTB/RIF核酸擴(kuò)增檢測

① 取1 mL痰標(biāo)本置放入預(yù)處理管中，然后加入液化液；② 渦旋振蕩15～30 s后靜置15分鐘，痰標(biāo)本充分液化后取2 mL加入反應(yīng)盒；③ 然后在檢測模塊中，放入反應(yīng)盒，儀器即自動化檢測開始進(jìn)行并報(bào)告結(jié)果。

三、質(zhì)量控制

本實(shí)驗(yàn)所有操作人員均通過中國疾病預(yù)防控制中心(簡稱中國CDC)組織的全國結(jié)核病分子診斷技術(shù)能力驗(yàn)證培訓(xùn)、江蘇省疾病預(yù)防控制中心(簡稱江蘇CDC)組織的痰涂片抗酸染色診斷技術(shù)能力驗(yàn)證培訓(xùn)，以及結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室藥物敏感測試培訓(xùn)。每次結(jié)果同時進(jìn)行陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)庫的建立采用EXCEL表格，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件，多組計(jì)數(shù)資料間的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,多組之間兩兩比較采用P值修正的方法,即P<0.05/K(K為需要比較的次數(shù))才能認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 四種方法檢測BALF情況比較

158例肺結(jié)核患者中，BALF涂片抗酸桿菌鏡檢、MGIT 960培養(yǎng)、PCR、Xpert 檢測的陽性率分別為25.3%、50.6%、38.0%、57.0%，四種方法聯(lián)合檢測總陽性率67.7%。Xpert MTB/RIF(χ2=32.672，P<0.001)、MGIT 960培養(yǎng)(χ2=21.497，P<0.001)、PCR檢測(χ2=5.852，P=0.016)陽性率明顯高于涂片抗酸桿菌。Xpert檢測陽性率明顯高于PCR檢測(χ2=11.422，P<0.001)，而與痰培養(yǎng)陽性率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.273，P=0.2592)。4種方法聯(lián)合檢測總陽性率明顯高于涂片抗酸染色(χ2=57.1，P<0.001)，結(jié)核培養(yǎng)(χ2=9.55，P=0.002)，PCR檢測(χ2=28.053，P<0.001)，Xpert MTB/RIF(χ2=3.896，P=0.048)任何單一檢測方法(見表1)。

表1 四種方法檢測158份BALF標(biāo)本的結(jié)果[例(構(gòu)成比，%)]

二、 以MGIT 960培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，涂片抗酸染色、PCR、Xpert MTB/RIF檢測支氣管肺泡灌洗液的檢測效能

Xpert檢測的敏感度和特異度分別為78.75%(63/80)和65.38%(51/78)，熒光定量PCR檢測的敏感度和特異度分別為66.25%(53/80)和91.03%(71/78)，涂片抗酸桿菌的敏感度和特異度分別為45.0%(36/80)和94.87%(74/78)(見表2)。

表2 以MGIT 960培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，涂片抗酸染色、Xpert MTB/RIF、PCR的檢測效能

三、Xpert MTB/RIF檢測BALF和痰液陽性率的比較

158例肺結(jié)核患者中，在BALF中Xpert陽性率為57.0%(90/158)，明顯高于痰液標(biāo)本中檢測的陽性率[32.3%(51/158)](χ2=19.479，P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表3)。

表3 Xpert MTB/RIF檢測BALF和痰液陽性率的比較[例(構(gòu)成比，%)]

討 論

一、Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)的原理及優(yōu)勢

Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)是一種以GeneXpert系統(tǒng)平臺及聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)原理為基礎(chǔ)的體外診斷技術(shù)，全自動一體化實(shí)時定量檢測。其以半巢式實(shí)時定量(Quantitative Real-time PCR)為技術(shù)基礎(chǔ)，以利福平(rifampicin，RIF)耐藥rpoB基因?yàn)榘谢?，自動提取DNA片段，并擴(kuò)增其基因的192bp片段，以進(jìn)行檢測的技術(shù)手段[3]；它采用6種分子信標(biāo)及檢測6種分子探針，5個分子探針相互重疊，分別以A、B、C、D、E命名， rpoB基因81bp核心的被選擇性覆蓋，并檢測出MTB對利福平是否耐藥情況[10]。Xpert MTB/RIF系統(tǒng)只需2 h便可以自動完成標(biāo)本的純化、離心及DNA的提取擴(kuò)增、檢測及結(jié)果讀出，并提示RFP耐藥情況[11]。該檢測系統(tǒng)另一大優(yōu)勢就是細(xì)菌污染可能性很小，和以往檢測方法不同，其試劑盒獨(dú)立儲存，操作快捷簡便。這些特點(diǎn)均卓越的顯示出Xpert MTB/RIF技術(shù)有別于涂片抗酸染色、熒光定量PCR等，檢測方法有極大的優(yōu)勢，受到WHO的高度重視及推崇[12]。

二、Xpert MTB/RIF檢測BALF對診斷活動性結(jié)核的重要價值

隨著電子支氣管鏡廣泛的臨床應(yīng)用，經(jīng)支氣管灌洗等檢查，成為診斷肺結(jié)核的主要方法之一，它不僅可以直接觀察支氣管內(nèi)黏膜病變并進(jìn)行BALF、刷檢和活檢，而且可以通過BALF結(jié)合分子生物學(xué)檢查，推動了肺結(jié)核的早期診斷得到有效發(fā)展。本研究中就可看出BALF Xpert檢測的敏感度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的涂片找抗酸桿菌及熒光定量PCR檢測，雖然與結(jié)核診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”結(jié)核培養(yǎng)的敏感性相差不大，但結(jié)核培養(yǎng)需要4～8周才能得到結(jié)果，而Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)2h即可出結(jié)果，并同時了解有無利福平耐藥，很大程度上極大縮短了檢測出病原學(xué)結(jié)果時間，故對肺結(jié)核、耐藥結(jié)核有早期診斷價值。

同時我們臨床上考慮到部分結(jié)核病患者痰液較少，因此無法留取優(yōu)質(zhì)痰標(biāo)本，痰液荷菌量少,從而降低了痰檢病原學(xué)陽性率。故本研究通過電子支氣管鏡檢測技術(shù)，收集了158例臨床診斷肺結(jié)核的支氣管鏡BALF標(biāo)本，分別進(jìn)行涂片、PCR、Xpert及結(jié)核培養(yǎng)，結(jié)果表明BALF Xpert檢測陽性率為57.0%，明顯高于PCR檢測(38.0%)及涂片找抗酸桿菌(25.3%)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與王蔚等[13]研究結(jié)果一致，表明BALF Xpert檢測能提高肺結(jié)核病原學(xué)確診率。與李妍等[14]報(bào)道的44例支氣管鏡BALF檢測陽性率(65.9%)相比稍低，考慮可能與標(biāo)本量及部分患者已抗癆7天，方做支氣管鏡檢查有關(guān)。而Xpert陽性率高于PCR檢測，主要由于Xpert MTB/RIF的技術(shù)基礎(chǔ)是半巢式實(shí)時熒光定量，靶基因?yàn)閞opb基因，而PCR 檢測中FAM是針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群IS6110基因，HEX診斷分枝桿菌屬HSP65基因，兩者采用不同的引物序列，導(dǎo)致Xpert敏感性高于PCR檢測。值得一提的是，我們同時統(tǒng)計(jì)了BALF中涂片抗酸染色、PCR、Xpert及結(jié)核培養(yǎng)四種檢測方法聯(lián)合檢測后發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測可使病原學(xué)陽性率提高到67.7%，也就是說接近2/3患者可以病原學(xué)確診肺結(jié)核。同時電子支氣管鏡BALF上述四種檢測方法聯(lián)合檢測能很大程度提高結(jié)核病原學(xué)陽性率，進(jìn)一步證實(shí)了廣泛開展電子支氣管鏡檢查，有助于肺結(jié)核早期病原學(xué)確診，對于肺結(jié)核早期診斷意義非凡。

同時需要關(guān)注的是，以BALF結(jié)核培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert檢測敏感度高達(dá)78.75%，明顯高于PCR檢測及涂片找抗酸桿菌，顯著提高了肺結(jié)核診斷的準(zhǔn)確率，漏診率大大減少。而特異度為65.38%，較PCR檢測及涂片找抗酸桿菌均偏低，不理想，可能與部分患者抗癆后7天，才做氣管鏡有關(guān)，由于抗癆有效后結(jié)核菌量明顯減少結(jié)核培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰而Xpert仍陽性。目前諸多研究均表明Xpert假陽性率較低[15-18]，而本研究的假陽性率可能為抗癆治療后病灶有吸收，抗癆治療有效，故考慮患者真的存在肺結(jié)核，但根據(jù)目前診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”不能確診的病例，所以進(jìn)一步說明聯(lián)合檢測的必要性。另外，BALF Xpert與PCR及結(jié)核培養(yǎng)檢測結(jié)果的符合率均較高，均達(dá)到70%以上，一致性較好，說明此檢測方法真實(shí)、有效、可靠，確實(shí)能提高肺結(jié)核病原學(xué)陽性率。

支氣管鏡BALF Xpert陽性率57.0%明顯高于痰Xpert檢測陽性率32.3%，說明支氣管鏡BALF檢測能明顯提高病原學(xué)陽性率，尤其對痰量較少或無痰的患者，氣管鏡檢測能提高肺結(jié)核的診斷率。近年來多項(xiàng)研究表明，支氣管鏡BALF中細(xì)菌學(xué)及分子生物學(xué)等相關(guān)檢測手段聯(lián)合，同時結(jié)合刷檢、病理活檢等多項(xiàng)指標(biāo)，能進(jìn)一步提高肺結(jié)核特別是菌陰肺結(jié)核及耐藥結(jié)核的正確診斷率[19-20]，這同時也需要我們進(jìn)一步更多的研究來證實(shí)。

綜上所述，肺結(jié)核是臨床上常見的呼吸道傳染病，提高肺結(jié)核的早期診斷率，同時防止誤診、漏診是不容忽視的問題。經(jīng)支氣管鏡提取BALF進(jìn)行Xpert MTB/RIF檢測，能明顯提高肺結(jié)核特別是耐藥結(jié)核的早期診斷率，為WHO根除結(jié)核病的目標(biāo)奠定了診斷基礎(chǔ)，值得臨床進(jìn)一步推廣使用。