陳穎，高宇

長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院, 湖北 荊州 434023

抗生素是由微生物自然產(chǎn)生或人為合成的一類化學(xué)物質(zhì)，其抗菌性能被廣泛應(yīng)用于治療細(xì)菌感染，并在農(nóng)業(yè)中作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加到動(dòng)物飼料中[1,2]。但是，不當(dāng)使用抗生素或長(zhǎng)期間接攝入食源性抗生素殘留物，可能會(huì)導(dǎo)致抗生素在體內(nèi)的積累，甚至產(chǎn)生一些具有抗菌耐藥性的超級(jí)細(xì)菌，嚴(yán)重威脅人類健康[3]，如過量使用氨基糖苷類抗生素之一的鏈霉素(streptomycin, STR)會(huì)導(dǎo)致聽覺神經(jīng)和腎臟損害等毒副作用[4]。因此，發(fā)展有效的抗生素檢測(cè)方法已成為迫切需求。

傳統(tǒng)的抗生素檢測(cè)方法主要是有生物法、高效液相色譜、氣-質(zhì)聯(lián)用、液-質(zhì)聯(lián)用等[5-9]，這些方法盡管較準(zhǔn)確，但也存在大多具有樣品前處理繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、成本高、儀器價(jià)格昂貴、需要專技人員維護(hù)等局限性。為了適應(yīng)抗生素檢測(cè)發(fā)展的需求，一批基于比色、電化學(xué)、電致化學(xué)發(fā)光、熒光等傳感器檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生[10]。其中，電化學(xué)由于具有靈敏度高、響應(yīng)快、選擇性好、操作簡(jiǎn)便且成本低等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注，并在抗生素的檢測(cè)中得到了一定應(yīng)用[11]。

靈敏度的提高是傳感器研究的一大關(guān)鍵問題，具體的實(shí)現(xiàn)途徑主要可歸為納米材料和生物放大策略的使用。金屬-有機(jī)框架材料(MOF)是近年來新興的一類由有機(jī)配體和金屬離子或團(tuán)簇通過配位鍵自組裝形成的有機(jī)-無機(jī)雜化材料。這種材料具有多孔性、大的比表面積及結(jié)構(gòu)功能的可調(diào)控性，有望實(shí)現(xiàn)在分析檢測(cè)中的應(yīng)用[12]。目前，一般將功能化MOF用作目標(biāo)物識(shí)別元件或信號(hào)分子的固載基質(zhì)，修飾于電極表面，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的識(shí)別和信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)及放大輸出[12-16]。但這通常需要復(fù)雜的修飾過程，操作較繁瑣。如何才能在不增加額外修飾步驟的前提下，簡(jiǎn)單地產(chǎn)生基于MOF的電化學(xué)信號(hào)呢?已有研究表明，MOF(UiO-66)具有吸附單鏈DNA(ssDNA)的能力[17-19]，如果利用該MOF直接修飾電極，通過吸附電活性分子標(biāo)記的ssDNA，就可簡(jiǎn)單地實(shí)現(xiàn)電化學(xué)信號(hào)的輸出。此外，作為生物放大策略之一的目標(biāo)物循環(huán)，一般是利用核酸酶的催化作用釋放被捕獲的目標(biāo)物，使得目標(biāo)物循環(huán)參與分子識(shí)別過程，達(dá)到n倍放大信號(hào)的目的。為了進(jìn)一步降低檢測(cè)出限，在傳感器的構(gòu)建中還可聯(lián)用兩種甚至多種信號(hào)放大策略，達(dá)到檢測(cè)信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大效果。

適體(aptamer, Apt)是用配體指數(shù)富集法系統(tǒng)演化(SELEX)技術(shù)篩選得到的一段能與靶分子特異性結(jié)合的寡核苷酸序列，具有靶分子范圍廣、親和力高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、易于獲取等優(yōu)點(diǎn)。為此，筆者構(gòu)建了一種基于酶輔助目標(biāo)物循環(huán)信號(hào)放大策略和MOF修飾電極的高靈敏電化學(xué)適體傳感器，并應(yīng)用于定量檢測(cè)以STR為模型目標(biāo)物的抗生素。STR與磁珠表面DNA雙鏈雜交體(dsDNA)中的適體鏈結(jié)合，形成3’端暴露的Apt-STR復(fù)合物，引發(fā)在核酸外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ)輔助下Apt-STR復(fù)合物中Apt的降解作用，釋放出STR循環(huán)參與生物識(shí)別過程[20]。由于Apt與STR的結(jié)合使得Apt從dsDNA中移除并釋放出標(biāo)記了二茂鐵的信號(hào)探針(Fc-SP)，在酶輔助目標(biāo)物循環(huán)作用下，少量STR即可從磁珠表面去除大量適體，繼而釋放出大量Fc-SP，吸附于MOF修飾電極表面。通過對(duì)電極表面的Fc-SP進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)STR的定量分析。由于酶輔助目標(biāo)物循環(huán)的高效信號(hào)放大能力，磁珠易于分離富集的優(yōu)點(diǎn)，及MOF修飾電極優(yōu)良的電化學(xué)性能和易操作性，該方法有望構(gòu)建靈敏高效簡(jiǎn)單的抗生素傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)STR的準(zhǔn)確分析。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

氯化鋯(ZrCl4),Aladdin化學(xué)試劑有限公司；2-氨基對(duì)苯二甲酸，Macklin生化科技有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和甲醇，錫龍化工有限公司。Tris-HCl、巰基己醇(MCH)，Sigma-Aldrich公司；核酸外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ)，New England Biolab公司。一次性印刷碳電極(SPCE)由碳工作電極(直徑3mm)、碳對(duì)電極和銀參比電極組成，Zensor R&D有限公司。雜交緩沖溶液(HB)由10mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl 及 1mmol/L MgCl2(pH=7.4)組成。羧基磁珠偶聯(lián)試劑盒(包含羧基化磁珠MB-COOH、活化液、偶聯(lián)液、封閉液、儲(chǔ)存液、N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(sulfo-NHS)),試驗(yàn)所用DNA訂購(gòu)于生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，其序列如下：

鏈霉素適體(STR Apt)：5’-GGGGTCTGTTCTGCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’適體互補(bǔ)鏈(NH2-cDNA)：5’-ACGACCCGACAGAACAAAGCAGCAGAACAGACCCC-(CH2)6-NH2-3’標(biāo)記二茂的鐵信號(hào)探針(Fc-SP)：5’-Fc-(CH2)6-CGGCGCATGCGTCGACCTGCAG-3試驗(yàn)過程中使用超純水經(jīng)雷磁超純水過濾凈化系統(tǒng)得到。電化學(xué)循環(huán)伏安法(CV)及方波伏安法(SWV)在CHI660E電化學(xué)工作站上操作完成。采用JEM2100F透射電子顯微鏡和布魯克D8 Advance x射線衍射儀表征所制備的UiO-66-NH2材料。

1.2 MOF(UiO-66-NH2)材料的合成

采用溶劑熱法合成了UiO-66-NH2MOF材料，步驟如下：首先，將0.2399g ZrCl4和0.1819g 2-氨基對(duì)苯二甲酸分散在50mL DMF中。充分?jǐn)嚢韬螅瑢⒃摶旌衔镛D(zhuǎn)移到100mL聚四氟乙烯內(nèi)襯高壓反應(yīng)釜中，在120℃下加熱反應(yīng)48h，然后自然冷卻至室溫。離心收集產(chǎn)物，用DMF/CH3OH徹底洗滌。最后，在90℃條件下干燥12h，即可得到UiO-66-NH2粉末。

1.3 MB-dsDNA共軛物的制備

將等物質(zhì)的量的STR Apt、NH2-cDNA與Fc-SP混合于雜交緩沖液中至三者最終濃度分別為2×10-6mol/L，將所得溶液水浴加熱至90℃保持5min，再緩慢降至室溫，整個(gè)降溫過程至少1h，形成具有- -NH2和- -Fc末端的DNA雙鏈體(dsDNA)。接著利用羧基磁珠偶聯(lián)試劑盒，通過dsDNA的- -NH2與MB-COOH發(fā)生酰胺化反應(yīng)，將dsDNA固定于MB表面，制備MB-dsDNA共軛物。具體步驟簡(jiǎn)述如下：首先，將100μL MB-COOH(50μg/μL)洗滌3次后分散于含有5mg的EDC和5mg的sulfo-NHS 的活化緩沖溶液中，搖床上溫育30min活化羧基。磁性分離上清液后，將活化后的MB-COOH (5μg/μL)與上述含有- -NH2末端dsDNA的偶聯(lián)緩沖液混勻，置于搖床上在室溫條件下溫育90min，以完成酰胺化反應(yīng)。隨后，磁性分離，棄去上清液，收集MB-dsDNA共軛物，向其中加入1mL封閉液，室溫下溫育30min。最后，將制備的MB-dsDNA共軛物洗滌并再次分散于1mL儲(chǔ)備液中，4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 STR傳感器的構(gòu)建

將SPCE置于20mmol/L Tis-HCl緩沖液(pH=7.4)中，設(shè)置電位范圍為-0.6～0.6V、掃速0.5V/s，進(jìn)行電化學(xué)CV掃描直至伏安圖穩(wěn)定為止，取出SPCE沖洗并用氮?dú)獯蹈?。將上述預(yù)處理好的SPCE浸入鐵氰化鉀溶液中掃描表征裸電極表面的電化學(xué)行為。SPCE沖洗吹干后，立即向碳工作電極區(qū)域滴加10μL制備好的MOF懸濁液(1mg/mL)，室溫晾干，使得碳工作電極表面形成一層均勻的MOF膜。以MB-dsDNA共軛物(1μg/μL)作為電化學(xué)探針，與含不同質(zhì)量濃度STR和Exo Ⅰ(200U/mL)的PBS溶液(0.1mol/L，含0.1mol/L的KCl，pH=7.4)在37℃條件下溫育30min，完成目標(biāo)物STR誘導(dǎo)在Exo Ⅰ作用下Apt的降解，釋放出Fc-SP。磁性分離后收集上清液，并分別與MOF/SPCE溫育2h。隨后采用SWV在10mmol/L PBS溶液中檢測(cè)對(duì)應(yīng)電極吸附Fc-SP所得電流強(qiáng)度。SWV檢測(cè)參數(shù)設(shè)置如下：電位掃描范圍為-0.2～0.6V，頻率為25Hz，振幅為25mV。

2 STR檢測(cè)原理

設(shè)計(jì)了一種基于酶輔助目標(biāo)物循環(huán)和MOF修飾電極的靈敏簡(jiǎn)單電化學(xué)適體傳感器，實(shí)現(xiàn)了以STR為模型目標(biāo)物的抗生素分析，具體原理如圖1所示。首先，將3種不同的DNA(STR Apt、NH2-cDNA、Fc-SP)退火雜交，形成具有氨基和二茂鐵修飾末端的DNA雙鏈體(NH2-dsDNA-Fc)，再通過酰胺化反應(yīng)將NH2-dsDNA-Fc修飾于MB-COOH表面，制備具有分子識(shí)別功能和電化學(xué)信號(hào)標(biāo)簽的MB-dsDNA共軛物。當(dāng)STR不存在時(shí)，Exo Ⅰ無法降解組裝于MB表面的dsDNA。一旦STR存在，它與固定于MB-dsDNA中的STR Apt結(jié)合，形成3’端暴露的Apt-STR復(fù)合物，致使dsDNA解旋，釋放出Apt和Fc-SP。含有3’端暴露適體的Apt-STR復(fù)合物激活Exo Ⅰ催化降解STR Apt，釋放出STR。釋放出的STR可再次與固定于MB表面的適體結(jié)合并在Exo Ⅰ作用下再次釋放，如此循環(huán)，即使少量的STR也能導(dǎo)致大量MB表面適體的移除，隨之釋放出大量Fc-SP。釋放出的Fc-SP與目標(biāo)物STR質(zhì)量濃度成正相關(guān)，通過MOF修飾電極將釋放出的Fc-SP吸附于電極表面實(shí)現(xiàn)電化學(xué)信號(hào)輸出。由于目標(biāo)物STR質(zhì)量濃度越高，釋放出的信號(hào)分子Fc-SP越多。電流強(qiáng)度隨著目標(biāo)物STR質(zhì)量濃度的增加而遞增，以此作為定量分析依據(jù)。由于Exo Ⅰ輔助目標(biāo)物循環(huán)的信號(hào)放大能力、MOF材料對(duì)信號(hào)探針的高效吸附及信號(hào)輸出能力，以及操作過程的便捷性，該方法有望實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單靈敏的STR分析。

圖1 電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)STR的原理示意圖Fig.1 Schematic illustration of the electrochemical biosensor for STR detection

3 結(jié)果與討論

3.1 UiO-66-NH2的表征

采用TEM對(duì)合成的MOF材料(UiO-66-NH2)進(jìn)行了形貌表征。圖2(a)顯示所制備材料呈現(xiàn)出均勻的顆粒形貌，平均直徑約為60～80nm，這與之前研究報(bào)道結(jié)果一致[14,21]。圖2(b) 為材料XRD表征，所得XRD圖譜也與之前文獻(xiàn)結(jié)果相符[14]。綜合TEM和XRD表征結(jié)果均表明了UiO-66-NH2的成功制備。

圖2 UiO-66-NH2的表征Fig.2 Characterization of UiO-66-NH2

3.2 傳感器制備過程的電化學(xué)表征及可行性分析

以[Fe(CN)6]3-/4-為氧化還原指示劑，采用循環(huán)伏安法研究了不同電極表面的電化學(xué)行為，如圖3(a)所示。從圖3(a)可以看出，裸SPCE呈現(xiàn)出一對(duì)可逆性良好的氧化還原特征峰(曲線a)。修飾上一層MOF之后，MOF/SPCE產(chǎn)生的峰電流強(qiáng)度略有下降(曲線b對(duì)比曲線a)，這是由于UiO-66-NH2與絕大多數(shù)MOF一樣導(dǎo)電性較差造成的。將定量的MB-dsDNA共軛物與含有不同質(zhì)量濃度STR和定量Exo Ⅰ的PBS溶液溫育后，磁性分離收集上清液。收集的上清液再溫育MOF/SPCE，所得峰電流強(qiáng)度呈現(xiàn)出進(jìn)一步下降的現(xiàn)象(曲線c)。這是由DNA負(fù)電荷磷酸鹽骨架與負(fù)電性[Fe(CN)6]3-/4-之間的排斥作用及空間位阻效應(yīng)所導(dǎo)致。以上結(jié)果表明DNA在MOF/SPCE表面的成功吸附，說明了傳感界面的成功制備，也初步反映了目標(biāo)物STR能夠誘導(dǎo)MB-dsDNA共軛物釋放出ssDNA(Fc-SP)。

為了進(jìn)一步評(píng)估傳感器構(gòu)建的可行性，研究了不同電極對(duì)應(yīng)的SWV響應(yīng)曲線，如圖3(b)所示。在無STR存在時(shí)，MOF/SPCE與反應(yīng)上清液溫育后，未觀察到峰電流(曲線a)，此為空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)的背景響應(yīng)信號(hào)。然而，當(dāng)MOF/SPCE與STR(5ng/mL)存在時(shí)的反應(yīng)上清液溫育后，產(chǎn)生了明顯的峰電流(曲線b對(duì)比a)，其峰電位與Fc氧化還原峰電位相當(dāng)，這意味著目標(biāo)物STR成功誘導(dǎo)MB-dsDNA解旋，釋放出Fc-SP并吸附于MOF/SPCE表面。因此，只有STR的存在才能導(dǎo)致固定于磁珠表面的dsDNA解旋釋放出信號(hào)探針Fc-SP，作為STR的定量分析依據(jù)，否則，STR誘導(dǎo)信號(hào)探針的釋放及其吸附都處于禁阻狀態(tài)。該結(jié)果再次證明了所構(gòu)建傳感器應(yīng)用于STR檢測(cè)的可行性。

注：a為裸SPCE，b為MOF/SPCE，c為MOF/SPCE溫育STR反應(yīng)上清液。圖3 電極逐步修飾過程的電化學(xué)表征Fig.3 Electrochemical characterization of the stepwise modified SPCE

3.3 靈敏性

對(duì)不同目標(biāo)物質(zhì)量濃度分別進(jìn)行了檢測(cè)并記錄數(shù)據(jù)，通過峰電流強(qiáng)度與對(duì)應(yīng)STR質(zhì)量濃度的關(guān)系評(píng)估了該方法的靈敏度。圖4(a)記錄了不同STR質(zhì)量濃度所對(duì)應(yīng)的SWV響應(yīng)信號(hào)。在目標(biāo)物STR不存在的空白對(duì)照試驗(yàn)中，未觀察到明顯的峰電流(曲線a)。當(dāng)STR存在時(shí)，對(duì)應(yīng)的SWV響應(yīng)信號(hào)呈現(xiàn)出峰電流(曲線b至h)，并且隨著STR質(zhì)量濃度的增加，檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于Fc的峰電流強(qiáng)度也相應(yīng)增加。這是由于高質(zhì)量濃度的STR可以使得固定于磁珠表面的dsDNA在Exo Ⅰ輔助下釋放出更多Fc-SP，吸附于MOF/SPCE表面，獲取電流強(qiáng)度劇烈增加的SWV信號(hào)。如圖4(b)所示，響應(yīng)電流強(qiáng)度與STR質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值在0.3～150ng/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，并估算出檢出限(LOD)約為0.2ng/mL。由于適體與目標(biāo)物STR的特異性識(shí)別作用、Exo Ⅰ酶輔助目標(biāo)物循環(huán)高效的信號(hào)放大能力及MOF/SPCE在信號(hào)分辨和放大方面的優(yōu)越性能，該方案相較于其他檢測(cè)方法而言[22-24]，顯現(xiàn)出相當(dāng)甚至更高的靈敏度以及較寬的檢測(cè)范圍。

注：曲線a至h分別對(duì)應(yīng)STR質(zhì)量濃度為0、0.3、0.5、1、2、5、20、150ng/mL。圖4 目標(biāo)傳感器的靈敏度評(píng)估Fig.4 Sensitivity evaluation of target biosensor

3.4 選擇性

為了評(píng)估傳感器對(duì)STR測(cè)定的選擇性，分別選取氯霉素(CAP)、卡那霉素(KAN)和土霉素(OTC)3種抗生素作為干擾物進(jìn)行測(cè)定。如圖5所示，相同質(zhì)量濃度(20ng/mL)的CAP、KAN和OTC對(duì)應(yīng)的SWV檢測(cè)響應(yīng)信號(hào)與空白試驗(yàn)相比差異不大。然而，即使對(duì)較低質(zhì)量濃度(2ng/mL)STR的測(cè)定，也得到了顯著的信號(hào)增量。這表明只有STR才能導(dǎo)致SPCE表面適體DNA鏈的去除，從而釋放出Fc-SP吸附于MOF/SPCE表面，產(chǎn)生信號(hào)。此外，使用STR和非目標(biāo)物抗生素的混合物進(jìn)行了交叉干擾實(shí)驗(yàn)：與STR的單獨(dú)檢測(cè)相比，混合物的存在也沒有引發(fā)峰值電流強(qiáng)度的明顯變化。這表明即使在共存條件下非目標(biāo)抗生素對(duì)STR也幾乎沒有干擾效應(yīng)。結(jié)果表明，該方法具有良好的選擇性。

圖5 目標(biāo)傳感器的選擇性評(píng)估 Fig.5 Selectivity evaluation of target biosensor

3.5 實(shí)際樣品中STR的檢測(cè)

通過對(duì)從湖北省荊州市當(dāng)?shù)爻蝎@得的牛奶樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，研究了該方法測(cè)定復(fù)雜樣品中STR的可行性。將牛奶樣品高速離心，經(jīng)微孔膜(0.22μm)過濾后，稀釋10倍，未檢測(cè)出STR。加入不同質(zhì)量濃度的STR進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，3種樣品的回收率分別為105%、98.2%和104%。該結(jié)果表明了傳感器具有實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品中STR檢測(cè)的應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

1)基于酶輔助目標(biāo)物循環(huán)的高效信號(hào)放大能力及MOF修飾電極優(yōu)良的電化學(xué)性能，筆者構(gòu)建了一種靈敏高效簡(jiǎn)單的抗生素適體傳感器。

2)該傳感器對(duì)STR的檢測(cè)具有較寬的線性范圍(0.3～150ng/mL)、低至0.2ng/mL的檢出限、良好的選擇性，并可用于實(shí)際牛奶樣品中的STR檢測(cè)。

3)該方法具有有效靈敏檢測(cè)抗生素STR的能力，為食品分析領(lǐng)域提供方法學(xué)支撐，為公共衛(wèi)生安全提供一定程度的技術(shù)支持。