徐崢嶸

(甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，蘭州 730000)

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)備及材料

試驗(yàn)動(dòng)物：試驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為做過PPD變態(tài)反應(yīng)的奶牛，共計(jì)350頭。

試驗(yàn)試劑：牛分枝桿菌重組抗原，采購自哈爾濱獸醫(yī)研究所；牛結(jié)核病標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，牛結(jié)核病標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，均采購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

其他所需試劑：兔抗牛IgG-HRP(辣根過氧化物酶)工作液、檸檬酸—磷酸鹽片、鄰苯二胺(OPD)、3%H2O2、磷酸鹽—吐溫緩沖液PBST、氯化鈉、濃硫酸等。

試驗(yàn)儀器及耗材：高速冷凍離心機(jī)、酶標(biāo)儀680型、恒溫箱、微量移液器、高壓滅菌鍋、電子天平、低溫冰箱、容量瓶、燒杯、移液器、量筒、廣口瓶、錐形瓶、離心管、TIP頭、采血管、手術(shù)剪、鑷子、一次性聚乙烯手套、口罩、乳膠手套、記號(hào)筆、標(biāo)簽紙、酒精棉球、計(jì)時(shí)器、報(bào)紙、棉線等。

1.2 牛結(jié)核病ELISA檢測(cè)方法操作步驟

1.2.1 抗原包被 首先用碳酸緩沖溶液按照1∶600的比例將牛分枝桿菌重組抗原進(jìn)行稀釋，然后依次加入50 μL稀釋抗原溶液與96孔微型板上，對(duì)照組加碳酸鹽緩沖溶液，振蕩混勻，加樣過程中每加一個(gè)孔必須換一個(gè)TIP頭。用封板膜封板后，放置于37 ℃恒溫箱內(nèi)，靜置90 min。

1.2.2 洗 板 慢慢揭開封板膜，將96孔微型板中的抗原包被液棄去，甩干之后在每孔加滿配制好的PBST溶液，吹吸混勻，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，最后在吸水紙上用力拍干，使洗液殘留量程度達(dá)到最低。

1.2.3 洗 板 洗板方法同1.2.2，反復(fù)洗板5次，拍干反應(yīng)板中的殘留液體。

1.2.4 加牛血清 將待檢奶牛血清稀釋1∶200倍，用微量移液器加入到96孔微型板中，每孔50 μL，充分吹吸混勻。分別設(shè)置陽性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔各2個(gè)，將陽性、陰性血清稀釋1∶100倍稀釋，用微量移液器吸取50 μL稀釋液分別加入到96孔微型板相應(yīng)對(duì)照孔內(nèi)，放置于37 ℃恒溫箱內(nèi)，靜置60 min。

1.2.5 洗 板 洗板方法同1.2.2，反復(fù)洗板5次，拍干反應(yīng)板中的殘留液體。

1.2.6 加入兔抗牛IgG-HRP工作液 將兔抗牛IgG-HRP工作液1∶1000倍稀釋，用微量移液器緩緩吸取50 μL兔抗牛IgG-HRP工作液依次加入到A1-H12每個(gè)孔中，用封板膜封板后，放置于37 ℃恒溫箱內(nèi)，孵育60 min。

1.2.7 洗 板 洗板方法同1.2.2，反復(fù)洗板5次，拍干反應(yīng)板中的殘留液體。

1.2.8 加入底物溶液和終止液 加入配制好的底物溶液，用微量移液器緩緩吸取50 μL，按順序加入到96孔微型板每個(gè)孔內(nèi)，輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后，放置于37 ℃恒溫箱內(nèi)，孵育15 min。

待上一步驟完成之后，按照之前加入底物溶液的順序，迅速在每孔加入50 μL的終止液，用微量振蕩器混勻孔內(nèi)液體，終止反應(yīng)。

1.3 測(cè) 定

開啟多功能酶標(biāo)儀，在492 nm波長(zhǎng)下，讀取每孔的吸光度值，同時(shí)用Excel表格記錄數(shù)據(jù)，便于后期進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 結(jié)果判定

根據(jù)公式S/P=(S-N)/(P-N)計(jì)算判定值，其中S代表樣品OD值；P代表陽性血清OD值；N代表陰性血清OD值。依據(jù)計(jì)算結(jié)果，進(jìn)行結(jié)果判定。

(1)陽性反應(yīng)：S/P≥0.5。

(2)疑似陽性：0.4

(3)陰性反應(yīng)：S/P<0.4。

2 PPD與ELISA檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果

用ELISA檢測(cè)的350份奶牛血清樣品，同時(shí)進(jìn)行了PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果見表1。由表1試驗(yàn)結(jié)果可以看出，檢測(cè)的350頭奶牛中，經(jīng)ELISA檢測(cè)結(jié)果檢出：呈陽性數(shù)量為2頭，陽性符合率為25%(2/8)；呈陰性數(shù)量為306頭，陰性檢出率為89.47%，陰性符合率為89.47%(306/342)，總符合率為88%(308/350)。兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果表明，所檢測(cè)奶牛場(chǎng)的結(jié)核桿菌感染率較低，且PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的陽性檢出率高于抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果，表明其敏感性高于抗體ELISA試驗(yàn)。

表1 ELISA檢測(cè)結(jié)果與PPD結(jié)果比較

3 結(jié) 論

目前，我國對(duì)奶牛結(jié)核病的檢測(cè)多采用PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法，該檢測(cè)方法是國家標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也被國際貿(mào)易方指定的檢測(cè)方法之一[1]。但單純使用PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法作為檢測(cè)奶牛結(jié)核病的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，效果并不是十分理想。首先，此方法存在的誤差較大，在大規(guī)模檢測(cè)中，容易出現(xiàn)陽性漏檢情況；其次，PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)容易出現(xiàn)假陽性的試驗(yàn)結(jié)果，考慮造成此種現(xiàn)象的原因，可能與PPD本身的產(chǎn)品質(zhì)量有關(guān)[2]。而ELISA作為現(xiàn)代血清檢測(cè)的主要方法，其操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、誤差小，適合短時(shí)間內(nèi)對(duì)大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查，但由于牛結(jié)核分枝桿菌的復(fù)雜性，導(dǎo)致其陽性檢出率低于PPD。因此，要徹底凈化奶牛結(jié)合病，必須要將兩種方法有效結(jié)合，取長(zhǎng)補(bǔ)短，才能為臨床牛結(jié)核病的防治工作提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。