余關(guān)龍，彭海淵，王世濤，汪國(guó)梁，陳宏，杜春艷，劉媛媛，孫士權(quán)，禹麗娥，王建武

（1長(zhǎng)沙理工大學(xué)水利工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410114；2湖南省環(huán)境保護(hù)河湖污染控制工程技術(shù)中心，湖南長(zhǎng)沙410114；3洞庭湖水環(huán)境治理與生態(tài)修復(fù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410114）

水環(huán)境中重金屬污染是當(dāng)前主要的環(huán)境問(wèn)題之一[1]。在許多工礦企業(yè)和電池、電鍍、半導(dǎo)體行業(yè)排放的廢水中存在大量重金屬鎘（Cd）[2]。鎘對(duì)于生物的代謝和生長(zhǎng)是非必要的，并且在各種重金屬污染中Cd(Ⅱ)因具有強(qiáng)烈的生物毒性和高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)而被認(rèn)定為最危險(xiǎn)的污染物之一[3]。而且Cd(Ⅱ)可以通過(guò)動(dòng)植物富集轉(zhuǎn)移進(jìn)入食物鏈，導(dǎo)致人體癌癥和嚴(yán)重的健康危害[4]。因此對(duì)水環(huán)境中Cd(Ⅱ)的修復(fù)研究具有重要意義。

目前，傳統(tǒng)的Cd(Ⅱ)污染處理方法主要有化學(xué)沉淀法、離子交換法、電化學(xué)法和膜過(guò)濾法等，但在實(shí)際應(yīng)用中存在處理成本高、易造成二次污染和產(chǎn)生大量有毒污泥的局限性。因此工藝簡(jiǎn)單且成本低廉的Cd(Ⅱ)污染修復(fù)方法越來(lái)越受到重視[5-6]。近年來(lái)，采用微生物法修復(fù)重金屬污染受到廣泛關(guān)注，因其修復(fù)過(guò)程環(huán)境友好且經(jīng)濟(jì)高效，特別是使用高耐受性微生物能夠?qū)崿F(xiàn)重金屬的原位修復(fù)而受到研究者的青睞[7]。微生物對(duì)重金屬Cd(Ⅱ)的去除主要通過(guò)細(xì)胞外富集和沉淀（細(xì)胞產(chǎn)物）、細(xì)胞表面的吸附和交換（通過(guò)官能團(tuán)或原始金屬離子）或通過(guò)代謝作用完成細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化[3,8]等途徑實(shí)現(xiàn)。通常高耐受性微生物用于環(huán)境中重金屬離子的修復(fù)具有明顯優(yōu)勢(shì)，但采用外源微生物進(jìn)行修復(fù)時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致位點(diǎn)的污染，因此篩選具有高去除效率的耐受性原位微生物對(duì)水環(huán)境中Cd(Ⅱ)的修復(fù)意義重大。

盡管微生物法處理重金屬?gòu)U水已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，但是仍然存在重金屬?gòu)U水處理后難于固液分離、微生物易流失和易受重金屬離子的毒害抑制作用而影響對(duì)重金屬離子的吸附效果[9-10]。為了克服這些缺點(diǎn)，許多研究者通過(guò)將單一的細(xì)菌、酵母或真菌進(jìn)行固定化，制成生物吸附劑后處理重金屬?gòu)U水[11-12]。文曉鳳等[13]通過(guò)將內(nèi)生菌Bacillus nealsonii固定化制成生物吸附劑，在最佳吸附處理?xiàng)l件下對(duì)Cd2+吸附率可達(dá)96%以上，并發(fā)現(xiàn)小球孔隙率大，利于Cd2+的吸附。Zhang等[14]利用聚乙烯醇（PVA）和海藻酸鈉（SA）作為包埋材料，制備了新型固定化硫酸鹽還原菌小球，處理含高濃度的Fe3+、Cu2+、Cd2+和Zn2+的合成酸性礦山廢水時(shí)，對(duì)硫酸鹽和重金屬的去除率分別達(dá)到61%～88%和99.9%。楊培等[5]通過(guò)SA凝膠包埋Chryseobacterium rhizosphaeraeSH-1而制成的生物吸附劑對(duì)Zn2+的去除率高達(dá)93.2%。眾多研究結(jié)果表明微生物可以通過(guò)游離和固定的形式從廢水中去除重金屬，而且微生物固定化可以提高生物吸附劑的機(jī)械強(qiáng)度以及微生物對(duì)重金屬的耐受性[15-17]。顯然，固定化生物吸附劑的吸附能力受到溶液中pH、重金屬離子種類及初始濃度、吸附劑投加量和吸附時(shí)間等影響，而很難得出一般性的通用結(jié)論，因此需對(duì)這些影響因素展開(kāi)深入研究。此外，不同的微生物固定化方法對(duì)重金屬離子的去除機(jī)理也有很大的影響。

綜上所述，目前采用包埋具有耐性的混合菌群制備固定化生物吸附劑吸附Cd(Ⅱ)的研究還較少。因此，本文將受重金屬污染原位微生物提取進(jìn)行重金屬濃度梯度篩選，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)對(duì)采用重金屬濃度梯度篩選后的微生物進(jìn)行生物鑒定并分析微生物的組成成分。然后將篩選后的微生物進(jìn)行包埋固定化，制成固定化生物吸附劑，考察了溶液初始pH、Cd(Ⅱ)初始濃度、生物吸附劑投加量和吸附時(shí)間等因素對(duì)Cd(Ⅱ)吸附效果的影響，并通過(guò)吸附平衡研究、比表面積測(cè)試法（BET）和傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法（FTIR-ATR）分別分析了其吸附類型和吸附容量、材料的孔隙結(jié)構(gòu)和吸附劑吸附Cd(Ⅱ)前后官能團(tuán)的變化等揭示其吸附機(jī)理。最后進(jìn)行了吸附解析和競(jìng)爭(zhēng)吸附實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其實(shí)用性能，以期能為包埋固定化耐性混合微生物吸附劑對(duì)水環(huán)境中重金屬的修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、硫酸鎘、硫酸鋅等，均為分析純。

立式壓力蒸汽滅菌鍋（DY04-13-44-00）、離心機(jī)（TG16-1）、金埃普（V-Sorb 2800）、賽默飛（IS5）、恒溫震蕩器（TS-2120）、超凈工作臺(tái)（VD-650）、紫外分光光度計(jì)（UV-2600）、原子吸收分光光度計(jì)（AAalyst700）、冷凍干燥機(jī)（BTP-3ESEOX）。

1.2 微生物來(lái)源與篩選

本文中微生物來(lái)自于處理重金屬Cd(Ⅱ)的水平潛流人工濕地基質(zhì)層中，微生物取樣深度為填料層（碎石）下15～20cm。將培養(yǎng)液（luria-bertani，LB）置于立式壓力蒸汽滅菌鍋中于121℃滅菌20min，在超凈工作臺(tái)中（后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在無(wú)菌環(huán)境進(jìn)行），將2～3g基質(zhì)樣品加至含100mL LB培養(yǎng)液的錐形瓶中。在28℃、150r/min的恒溫震蕩器中培養(yǎng)48h，然后取1mL菌液在LB培養(yǎng)液中接種培養(yǎng)，按此步驟重復(fù)3次培養(yǎng)后，再取1mL菌液依次加入含Cd(Ⅱ)濃度為20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L、140mg/L、160mg/L、180mg/L和200mg/L的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行重金屬濃度梯度的培養(yǎng)以篩選微生物。在各濃度梯度中培養(yǎng)48h后，取1mL菌液接種至下一濃度，并取培養(yǎng)液樣品過(guò)0.22μm濾膜檢測(cè)水樣中的重金屬濃度。每隔24h以空白培養(yǎng)液為對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)不同Cd(Ⅱ)濃度下培養(yǎng)液在600nm波長(zhǎng)處的吸光值（OD600）。當(dāng)菌液經(jīng)Cd(Ⅱ)濃度為200mg/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，取1mL接種至Cd(Ⅱ)濃度為50mg/L的LB培養(yǎng)液中。每隔48h接種1次，此時(shí)培養(yǎng)的微生物為篩選后的對(duì)Cd(Ⅱ)耐受性高的微生物，并將此培養(yǎng)液稱為種液。

1.3 固定化生物吸附劑的制備

1.3.1 菌懸液制備

取1mL種液至LB培養(yǎng)液，在28℃、150r/min下的恒溫震蕩器中培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)液倒入干凈離心管中，在4°C、4500r/min條件下的離心機(jī)中離心15min，傾倒上清液，用無(wú)菌生理鹽水洗滌2～3次，保存至4°C的冰箱備用（可保存5天）。

1.3.2 生物吸附劑的制備

稱取聚乙烯醇（PVA）6%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）和海藻酸鈉（SA）2%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）溶解在100mL去離子水中形成包埋劑。攪拌均勻使PVA和SA不粘在瓶壁，浸泡5～10min；稱取CaCl20.5%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）溶解于飽和H3BO3溶液中形成交聯(lián)劑。將以上溶液置于立式壓力蒸汽滅菌鍋中于121℃滅菌20min，取出后冷卻至室溫。向包埋劑中加入菌懸液，使菌懸液濃度為5%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）并攪拌均勻制成混合液。將混合液加至10mL注射器使其自然緩慢滴入交聯(lián)劑中，邊滴邊搖動(dòng)瓶身形成類球型的固定化微生物小球（即固定化生物吸附劑）。在4℃的冰箱中交聯(lián)反應(yīng)12h，再取出用無(wú)菌生理鹽水潤(rùn)洗2～3次，放入4℃冰箱備用。

1.4 Cd(Ⅱ)吸附實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 吸附影響因素實(shí)驗(yàn)

通過(guò)改變pH、Cd(Ⅱ)初始濃度、固定化生物吸附劑用量和吸附時(shí)間來(lái)探究生物吸附劑吸附Cd(Ⅱ)的影響。采用單因素實(shí)驗(yàn)，均在150r/min、28℃恒溫震蕩器中進(jìn)行，每隔一定時(shí)間取樣過(guò)0.22μm濾膜，用原子吸收分光光度計(jì)分析溶液中重金屬離子濃度，每個(gè)樣品設(shè)定3個(gè)平行樣，測(cè)量結(jié)果取平均值。其中pH變化范圍2～6，使用0.1mol/L的H2SO4和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH；Cd(Ⅱ)初始濃度變化范圍40～200mg/L；固定化生物吸附劑投加量變化范圍10～60g/L（濕重）；吸附時(shí)間為12～60h。

1.4.2 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

探究固定化生物吸附劑吸附動(dòng)力學(xué)模型，Cd(Ⅱ)初始濃度為50mg/L、100mg/L和150mg/L，固定化生物吸附劑投加量為50g/L，pH為4.5，在28℃、150r/min的恒溫震蕩器中進(jìn)行，檢測(cè)0～480min不同時(shí)間段的重金屬濃度。由于在吸附前期微生物存在復(fù)蘇階段，因此先將材料在28℃、150r/min搖床中運(yùn)行36h，再加入重金屬離子和調(diào)節(jié)pH進(jìn)行準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)研究。

1.4.3 吸附等溫實(shí)驗(yàn)

探究Freundlich模型和Langmuir模型，在28℃、150r/min的恒溫震蕩器中進(jìn)行，其中固定化生物吸附劑投加量為50g/L，溶液pH為4.5，吸附時(shí)間48h，對(duì)20～200mg/L濃度范圍的Cd(Ⅱ)進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)在每個(gè)濃度下吸附達(dá)到平衡時(shí)的Cd(Ⅱ)濃度和計(jì)算出相應(yīng)的吸附容量。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，與兩種吸附等溫線模型進(jìn)行擬合，以擬合的相關(guān)性高低來(lái)判斷吸附類型。

1.5 固定化生物吸附劑的結(jié)構(gòu)表征

1.5.1 BET

對(duì)固定化生物吸附劑吸附Cd(Ⅱ)前后的樣品先進(jìn)行12h冷凍干燥處理，再用金埃普（V-Sorb 2800）進(jìn)行BET測(cè)試，通過(guò)檢測(cè)得出吸附脫附曲線和孔徑分布曲線，分析吸附前后的比表面積、孔體積、孔隙率變化情況。

1.5.2 FTIR-ATR

對(duì)固定化生物吸附劑吸附Cd(Ⅱ)前后的樣品進(jìn)行表面官能團(tuán)的表征，將樣品進(jìn)行12h冷凍干燥處理，再將樣品置于兩片干凈稱量紙中壓成薄片，取少量樣品置于金剛石ATR模塊中，波數(shù)范圍4000～400cm-1，掃描次數(shù)32，分辨率4cm-1，用賽默飛（IS5）進(jìn)行紅外光譜儀測(cè)試。

1.6 微生物分析

1.6.1 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分級(jí)

通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)[8,18]中提供的方法改進(jìn)后獲得本研究中亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分析方法。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程分為兩步：第一步樣品的制備，取1mL種液分別接種至含100mg/L Cd(Ⅱ)的LB培養(yǎng)液和空白LB培養(yǎng)液中，在28℃、150r/min的恒溫震蕩器培養(yǎng)48h，取樣分析，將樣品在4℃、6000g離心力下離心10min，并用pH為7的磷酸緩沖溶液清洗兩次去除培養(yǎng)液，將離心后的上清液和微生物分別保存在4℃冰箱備用，第二步亞細(xì)胞分級(jí)，將上述樣品用含有0.1mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）、pH 8.0的1mL 0.03mol/L Tris緩沖溶液在12000g離心力下洗滌3次，每次2min，將上清液收集在干凈離心管中4℃冰箱保存，并將此溶液稱為細(xì)胞外膜溶液。將沉淀物重新懸浮在上述Tris緩沖液中，制備原生質(zhì)體，加入溶菌酶，使溶菌酶濃度為600μg/mL，并在25℃下將細(xì)胞培養(yǎng)30min，將原生質(zhì)體在2576g、4℃下離心15min收集，所獲得的上清液是由肽聚糖層組成的周質(zhì)液體，放入干凈離心管4℃冰箱保存。將沉積物重新懸浮在包含0.1mol/L EDTA、pH為8.1的0.03mol/L Tris緩沖液中，然后用超聲波破碎機(jī)對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行2次破碎，每次30s，然后在12000g離心力下離心2min，上清液為細(xì)胞質(zhì)溶液，沉積物為細(xì)胞內(nèi)膜，收集于干凈離心管中置于4℃冰箱保存。取一定量以上樣品于聚四氟乙烯燒杯中，加入5mL濃硝酸，在150℃下高溫消解，再通過(guò)原子吸收分光光度計(jì)檢測(cè)重金屬離子。

1.6.2 微生物鑒定

采用PCR技術(shù)對(duì)篩選后的微生物進(jìn)行鑒定，測(cè)序結(jié)果分析使用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的網(wǎng)絡(luò)云平臺(tái)，其具體PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)

1.7 固定化吸附劑實(shí)用性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1.7.1 吸附解析實(shí)驗(yàn)

吸附實(shí)驗(yàn)條件：Cd(Ⅱ)初始濃度100mg/L，溶液pH為4.5，固定化生物吸附劑投加量為50g/L，在150r/min、28℃的恒溫震蕩器中運(yùn)行48h。

解吸實(shí)驗(yàn)條件：收集吸附重金屬離子后的固定化吸附劑，加入50mL硝酸溶液（0.1mol/L），在150r/min、28℃恒溫震蕩器中解吸40min。

1.7.2 常見(jiàn)離子競(jìng)爭(zhēng)吸附實(shí)驗(yàn)

在借助信息技術(shù)開(kāi)展小學(xué)語(yǔ)文教學(xué)的過(guò)程中，教師的教學(xué)觀念起著決定性的作用。因此，在實(shí)際的教學(xué)過(guò)程中，教師首先要對(duì)自身的教學(xué)觀念進(jìn)行優(yōu)化，重視信息教學(xué)，以提升學(xué)生的綜合素養(yǎng)；其次，教師還需要提升自身運(yùn)用信息技術(shù)的能力，能夠合理地運(yùn)用該種技術(shù)開(kāi)展教學(xué)，以促進(jìn)學(xué)生的綜合發(fā)展。

水環(huán)境中常見(jiàn)離子Na+、K+、Ca2+對(duì)Cd(Ⅱ)的競(jìng)爭(zhēng)吸附通過(guò)在含有Cd(Ⅱ)濃度為100mg/L的溶液中分別加入陽(yáng)離子Na+、K+、Ca2+，使其濃度為50mg/L、100mg/L、150mg/L，其中陰離子類型均為氯離子，在pH為4.5，固定化生物吸附劑投加量為50g/L，在150r/min、28℃恒溫震蕩器中運(yùn)行48h后取樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐受性微生物的篩選

從圖1(a)中可以看出，隨著Cd(Ⅱ)濃度的逐漸提高，OD600值不斷降低，說(shuō)明微生物的生長(zhǎng)受到Cd(Ⅱ)的抑制與毒害作用，其中部分不能耐受Cd(Ⅱ)的微生物被淘汰。而在整個(gè)篩選過(guò)程，48h的OD600值均大于24h的值，且在Cd(Ⅱ)濃度小于60mg/L的情況下相差較大，表明耐性微生物的篩選在24h內(nèi)已經(jīng)完成，微生物逐漸適應(yīng)培養(yǎng)基的環(huán)境并利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行繁殖。OD600值在Cd(Ⅱ)濃度為100mg/L、120mg/L、140mg/L和160mg/L的情況下趨于平穩(wěn)，下降趨勢(shì)漸緩。這是因?yàn)榕囵B(yǎng)液中的微生物種類逐漸穩(wěn)定，不能耐受Cd(Ⅱ)脅迫的微生物得到了篩除。在Cd(Ⅱ)濃度為200mg/L的情況下，經(jīng)過(guò)24h的培養(yǎng)，OD600值在0.7～0.8，說(shuō)明微生物生長(zhǎng)狀況良好，但從OD600值的趨勢(shì)可以看出在200mg/L時(shí)Cd(Ⅱ)對(duì)微生物的抑制與毒害作用最為明顯。

在圖1(b)中，隨著Cd(Ⅱ)濃度的提高，Cd(Ⅱ)的去除率也在不斷提高，當(dāng)Cd(Ⅱ)濃度為120mg/L時(shí)Cd(Ⅱ)的去除率最大68.3%。隨著Cd(Ⅱ)濃度繼續(xù)提高，去除率呈下降趨勢(shì)，而從圖1(a)中可以看出，OD600值呈顯著下降趨勢(shì)，此時(shí)的微生物受到Cd(Ⅱ)的抑制與毒害作用不斷增大，影響正常的繁殖與代謝功能。重金屬濃度區(qū)間在60～180mg/L時(shí)，生物吸附劑對(duì)重金屬的去除率趨于平緩，結(jié)合圖1(a)，此時(shí)的微生物菌群對(duì)Cd(Ⅱ)的去除更加穩(wěn)定可靠。

圖1 微生物重金屬濃度梯度篩選

圖2為經(jīng)Cd(II)濃度梯度篩選后種液中微生物的種水平分布圖。從圖中可以看出，種液中菌種的豐 度 大 小 順 序 為L(zhǎng)actococcus＜Stenotrophomonas＜Serratia＜Pseudomonas，其中其他組是豐富度占比小于0.01的微生物合并組成。通過(guò)文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)Lactococcus[19-20]、Stenotrophomonas[21]、Serratia[22-24]、Pseudomonas[25-26]均對(duì)Cd(Ⅱ)具有較高的耐受性和吸附能力。

2.2 吸附影響因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 pH對(duì)吸附效果的影響

由圖3可知，溶液pH對(duì)固定化生物吸附劑吸附Cd(Ⅱ)的影響較大。當(dāng)溶液pH從2增加到4時(shí)，去除率逐漸增加。而對(duì)大多數(shù)生物吸附劑而言，極高和極低的pH都不利于生物吸附劑吸附重金屬離子[27]。溶液pH為2時(shí)效果最差，此時(shí)Cd(Ⅱ)的去除率僅為34.67%。這是因?yàn)槿芤褐写嬖诖罅康腍+，這些H+能與生物吸附劑表面的陽(yáng)離子吸附位點(diǎn)相結(jié)合，使得生物吸附劑與重金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)減少；且極低的pH環(huán)境對(duì)微生物的活性有較大影響，導(dǎo)致菌群對(duì)Cd(Ⅱ)的吸附效果較差，但這一結(jié)果并不適用所有固定化生物吸附劑。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)在pH為2.7的條件下，固定化硫酸鹽還原菌對(duì)高重金屬濃度的合成酸性礦山廢水中Fe3+、Cu2+、Cd2+和Zn2+去除達(dá)到99.9%。當(dāng)溶液pH從4增加到5時(shí)，處理效果最佳，Cd(Ⅱ)的去除率達(dá)到了91%±2%。隨著pH的升高去除率升高的原因可能是固定化生物吸附劑上的官能團(tuán)產(chǎn)生了去質(zhì)子化現(xiàn)象，從而形成了帶負(fù)電荷的重金屬吸附點(diǎn)位，使得更多的Cd(Ⅱ)被吸附去除。而相同條件下，未固定化微生物對(duì)Cd(Ⅱ)的去除率僅為50%±5%。當(dāng)溶液pH增加到6時(shí)，去除效果呈下降趨勢(shì)，另外在調(diào)節(jié)pH時(shí)溶液中出現(xiàn)一些氧化物或氫氧化物不溶物。顯然，去除效果隨pH的升高出現(xiàn)下降與溶液中生成的金屬氧化物或氫氧化物不溶物有關(guān)，這些不溶物可能造成了固定化生物吸附劑表面空隙堵塞，影響了材料的傳質(zhì)性能。這些結(jié)論與其他研究者[13,15,28]的研究結(jié)果相一致。以上結(jié)果表明pH在4～5時(shí)固定化生物吸附劑對(duì)Cd(Ⅱ)的吸附效果最佳，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇在pH為4.5下進(jìn)行。

2.2.2 初始濃度對(duì)吸附效果的影響

圖2 種液中微生物種水平分布

圖3 pH對(duì)吸附效果的影響

圖4 Cd(Ⅱ)初始濃度對(duì)吸附效果的影響

如圖4所示，當(dāng)Cd(Ⅱ)初始濃度在40～100mg/L范圍時(shí)，去除率緩慢提高。隨著濃度的增加，重金屬離子的擴(kuò)散速率增加，提高了固定化生物吸附劑上有效吸附點(diǎn)位的利用效率。而Cd(Ⅱ)初始濃度在100～200mg/L時(shí)，Cd(Ⅱ)去除率隨著初始濃度的提高而呈下降趨勢(shì)，這可能歸因于隨著Cd(Ⅱ)濃度的不斷提高，固定化生物吸附劑上能與Cd(Ⅱ)相結(jié)合的有效吸附點(diǎn)位被充分利用，因此Cd(Ⅱ)濃度的擴(kuò)散速率提高導(dǎo)致吸附劑上沒(méi)有足夠的有效吸附點(diǎn)位與重金屬離子結(jié)合。這一結(jié)論與文獻(xiàn)[12-13]得出的Cd(Ⅱ)初始濃度對(duì)生物吸附劑吸附效果影響的結(jié)論相吻合。但隨著初始濃度的提高，生物吸附劑對(duì)Cd(Ⅱ)的吸附量提高了。Huang等[29]也指出隨著Cd(Ⅱ)濃度的提高，生物吸附劑對(duì)Cd(Ⅱ)的吸附量增加，而去除率降低。另一方面，不斷提高的Cd(Ⅱ)濃度對(duì)于固定化生物吸附劑中微生物的生物毒性不斷增大，微生物的生長(zhǎng)與代謝受到影響，從而影響了去除效果，這與文獻(xiàn)[8,30-31]的結(jié)論一致。Zhou等[32]研究指出，使用游離微生物吸附劑在Cd(Ⅱ)濃度為50mg/L時(shí)的吸附效果最佳，但隨著濃度增加到100mg/L時(shí)，去除率急劇下降，其研究結(jié)果表明在高Cd(Ⅱ)濃度下微生物的正常代謝功能受到了抑制，體現(xiàn)了本文使用固定化生物吸附劑提高微生物特別是混合菌群對(duì)重金屬耐受性方面的優(yōu)點(diǎn)。為避免高濃度重金屬的抑制影響，后續(xù)影響因素實(shí)驗(yàn)均在Cd(Ⅱ)初始濃度100mg/L下進(jìn)行。

2.2.3 投加量對(duì)吸附效果的影響

如圖5所示，隨著固定化生物吸附劑投加量的增加，去除率不斷增加。當(dāng)固定化生物吸附劑投加量為50g/L（濕重）時(shí)吸附效果最佳。這是由于固定化生物吸附劑的投加量增大使重金屬吸附位點(diǎn)增多造成的。當(dāng)投加量超過(guò)50g/L后，隨投加量的增加去除率不再提高，而是趨于平穩(wěn)和略微下降。其原因可能是隨著固定化生物吸附劑數(shù)量的增加，固定生物吸附劑間的團(tuán)聚作用限制了有效比表面積和吸附位點(diǎn)的增加甚至使之減少。這些結(jié)果與其他[1,13]的結(jié)論類似。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇投加量為50g/L進(jìn)行。

圖5 投加量對(duì)吸附效果的影響

2.2.4 吸附時(shí)間對(duì)吸附效果的影響

圖6為吸附時(shí)間對(duì)固定化生物吸附劑吸附Cd(Ⅱ)的影響。從圖中可以看出，吸附時(shí)間對(duì)固定化生物吸附劑處理含Cd(Ⅱ)廢水的影響較大。隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，12～48h的去除率不斷提高，在吸附時(shí)間為48h去除率達(dá)到最高。繼續(xù)延長(zhǎng)吸附時(shí)間至48～60h，去除效果趨于平穩(wěn)，說(shuō)明固定化生物吸附劑的重金屬吸附位點(diǎn)已被充分利用。因此，最佳的吸附時(shí)間為48h。

圖6 吸附時(shí)間對(duì)吸附效果的影響

從表2中數(shù)據(jù)可知，固定化微生物吸附的量占溶液中總Cd(Ⅱ)含量的75.2%，其中細(xì)胞外膜的Cd(Ⅱ)含量達(dá)到22.6%，而細(xì)胞外膜的吸附容易產(chǎn)生離子的脫附，使得吸附效果不穩(wěn)定，而本文采用的微生物固定化技術(shù)能改善這一現(xiàn)象。經(jīng)分析，微生物亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)Cd(Ⅱ)總含量為52.6%。其中，細(xì)胞內(nèi)膜對(duì)重金屬離子的吸附貢獻(xiàn)最大，占亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中總Cd(Ⅱ)含量的60.9%。這與Kumar[18]和Bai[30]等的研究結(jié)果有所不同，他們認(rèn)為重金屬離子主要吸附在細(xì)胞壁上。Li等[8]通過(guò)對(duì)不同時(shí)間段的微生物進(jìn)行亞細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的增加Cd(Ⅱ)在亞細(xì)胞中的分布會(huì)發(fā)生變化。菌株大概需要0.5h才能將Cd(Ⅱ)主動(dòng)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中，而這個(gè)過(guò)程可能涉及擴(kuò)散、吸附、鰲合、絡(luò)合和微沉淀，結(jié)合圖6，12～48h小球內(nèi)部微生物可能正經(jīng)歷這一過(guò)程。

表2 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的Cd(Ⅱ)吸附量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%）

2.3 吸附動(dòng)力學(xué)模型

圖7為固定化生物吸附劑對(duì)Cd(Ⅱ)的吸附動(dòng)力學(xué)擬合曲線。從表3中可以看出相較于準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的R2值更高，說(shuō)明固定化生物吸附劑對(duì)Cd(Ⅱ)的吸附更加符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，影響吸附反應(yīng)的主要因素是化學(xué)鍵的形成，隨著Cd(Ⅱ)濃度的提高其反應(yīng)速率常數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.4 吸附等溫模型

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合后得到Freundlich方程為lnqe=1.7338+0.4707lnCe，其中，qe為吸附平衡時(shí)吸附容量，mg/g；Ce為吸附平衡時(shí)溶液中Cd(Ⅱ)的濃度，mg/L。Langmuir方 程 為1/qe=0.0291+0.2446/Ce。根據(jù)Freundlich和Langmuir方程進(jìn)行吸附等溫線擬合，結(jié)果見(jiàn)圖8。表4列出了等溫吸附模型參數(shù)，兩種吸附模型的R2均較大，Langmuir模型為0.9945，F(xiàn)reundlich模型為0.9826，說(shuō)明固定化生物吸附劑對(duì)Cd(Ⅱ)的吸附過(guò)程用這兩類模型都能較好擬合。但是比較而言，Langmuir模型的R2值更大，所以固定化生物吸附劑對(duì)Cd(Ⅱ)的吸附過(guò)程更適用Langmuir模型描述，Langmuir模型將吸附過(guò)程描述為一個(gè)可逆的平衡過(guò)程，在吸附劑表面均勻分布的獨(dú)立活性結(jié)合位點(diǎn)上進(jìn)行吸附，每個(gè)位點(diǎn)只與一個(gè)分子結(jié)合。一般來(lái)說(shuō)，Langmuir模型描述的是均相吸附，而Freundlich模型描述的是在非均相吸附劑上進(jìn)行的過(guò)程。因此，此固定化生物吸附劑對(duì)Cd(Ⅱ)的吸附過(guò)程是一個(gè)可逆的平衡過(guò)程，在吸附劑表面均勻分布的獨(dú)立活性結(jié)合位點(diǎn)上進(jìn)行，屬于均相吸附，由此計(jì)算出對(duì)Cd(Ⅱ)的最大單分子層吸附量為34.4mg/g。

圖7 吸附動(dòng)力學(xué)擬合曲線

表3 Cd(Ⅱ)動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)

2.5 固定化生物吸附劑結(jié)構(gòu)表征

2.5.1 BET分析

圖8 吸附等溫線擬合

表4 等溫吸附模型參數(shù)

表5 材料孔結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)

表5為材料孔結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，從表中可以看出，固定化生物吸附劑在經(jīng)過(guò)重金屬離子吸附實(shí)驗(yàn)后其比表面積、孔體積均有增加，而孔徑減小。一方面原因是材料內(nèi)的PVA或SA在水溶液中溶解了一部分，另一方面可能是由于微生物的生長(zhǎng)繁殖與新陳代謝作用使得材料內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（孔道更通暢）。圖9為吸附前后BET分析曲線，圖9(a)曲線低壓端（0～0.1）明顯偏向X軸，說(shuō)明材料與N2作用弱。而且也可以看出吸附-脫附曲線均出現(xiàn)了滯后環(huán)，且均是H3型，說(shuō)明材料中有片狀粒子堆積形成的狹縫孔，即兩種吸附劑均有介孔結(jié)構(gòu)存在[33]。由圖9(b)可知，兩種材料均有介孔和大孔，介孔段所占的比例較高，這些孔結(jié)構(gòu)有利于微生物的附著與生長(zhǎng)，同時(shí)也有較高的傳質(zhì)性能，對(duì)Cd(Ⅱ)的吸附更加有利，比表面積數(shù)據(jù)較馮克等[34]的更好，和李驊[35]、王青松[36]等的研究結(jié)果較為接近。

圖9 吸附前后BET分析曲線

2.5 .2 FTIR-ATR分析

圖10 固定化生物吸附劑吸附Cd(Ⅱ)前后的FTIR-ATR譜圖

圖10為固定化生物吸附劑吸附Cd(Ⅱ)前后的FTIR-ATR譜圖，闡明了吸附劑在吸附Cd(Ⅱ)前后官能團(tuán)的變化情況。因?yàn)椴牧鲜枪腆w材料，制成樣品較大，適用于ATR模式，因此峰的偏移程度和指紋區(qū)不明顯。從吸附前的FTIR-ATR譜圖可以看出，在3000cm-1以上存在3246cm-1的寬強(qiáng)峰，屬于—OH基團(tuán)伸縮振動(dòng)峰，也可能存在不飽和基團(tuán)（羧基、羰基、氨基），由于氫鍵的作用而使得峰較寬。在2917cm-1處為—CH不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰。在1601cm-1存在C==C的伸縮振動(dòng)與—NH的剪刀彎曲振動(dòng)，關(guān)于N—H的推斷可以從819cm-1處看到N—H的搖擺振動(dòng)中得到證實(shí)。在1410cm-1是—OH彎曲振動(dòng)峰與—CH的剪刀彎曲振動(dòng)，由于其他基團(tuán)（可能是羰基或羧基）的共振作用，發(fā)生位移。1079cm-1和1032cm-1處是由C—O產(chǎn)生的伸縮振動(dòng)峰。從圖中還可以看出，在(2500±300)cm-1出現(xiàn)細(xì)微波動(dòng)，而這是—COOH基團(tuán)的特征區(qū)域，可能是由于大量微生物的存在引起的。對(duì)比吸附前3246cm-1處的峰，吸附后的峰偏離到3252cm-1，可能有不飽和基團(tuán)參與了Cd(Ⅱ)的吸附，在1601cm-1處吸附后峰值右移，說(shuō)明有C==C參與了Cd(Ⅱ)的吸附過(guò)程，綜合3246cm-1、1601cm-1和819cm-1處峰值的變化，對(duì)Cd(Ⅱ)的吸附過(guò)程可能有蛋白質(zhì)的參與?？傮w來(lái)說(shuō)，在固定化生物吸附劑中含有較為豐富的基團(tuán)，這對(duì)吸附反應(yīng)過(guò)程較為有利，Cd(Ⅱ)的去除與—COOH、—OH、—NH、—CH等基團(tuán)有關(guān)[5,8,29]。

2.6 實(shí)用性能實(shí)驗(yàn)

2.6.1 吸附解析

為了探究固定化生物吸附劑的經(jīng)濟(jì)實(shí)用性能，將材料進(jìn)行了吸附解吸重復(fù)利用實(shí)驗(yàn)。圖11為吸附解吸次數(shù)對(duì)固定化生物吸附劑吸附Cd(Ⅱ)的影響。當(dāng)使用次數(shù)超過(guò)3次后，去除率大大下降，Cd(Ⅱ)去除率從91.8%下降至53.1%，下降了38.7%。在第4、第5、第6次使用時(shí)，去除率保持平穩(wěn)。吸附效果低的原因可能是吸附解吸過(guò)程對(duì)材料內(nèi)微生物造成了破壞，降低了微生物的活性。這一結(jié)果與楊培等[5]的研究結(jié)果類似?；魟P利[37]的研究也表明生物吸附劑的解析時(shí)間、解析試劑類型（EDTA、HNO3、HCl）與濃度對(duì)材料有一定的影響，后續(xù)研究可以進(jìn)一步優(yōu)化此方面內(nèi)容，提高重復(fù)利用次數(shù)。

2.6.2 競(jìng)爭(zhēng)吸附

圖11 使用次數(shù)對(duì)Cd(Ⅱ)去除率的影響

圖12為常見(jiàn)陽(yáng)離子對(duì)Cd(Ⅱ)吸附的影響。由圖可知，此時(shí)溶液中Cd(Ⅱ)濃度為100mg/L，隨著Na+、K+、Ca2+離子濃度的不斷提高，三者對(duì)Cd(Ⅱ)吸附的影響也在增加，但影響程度不盡一致。其中Na+的影響微乎其微，在最高濃度150mg/L時(shí)去除率下降了1.8%±0.5%。而K+的影響較Na+大，在最高濃度150mg/L時(shí)去除率下降了5.1%±0.5%。Ca2+影響最大，在Ca2+濃度分別為50mg/L、100mg/L和150mg/L時(shí)去除率分別下降了5.3%±0.5%、7.7%±0.5%和13.5%±0.5%。綜上所述，水環(huán)境中的Na+和K+在較低濃度時(shí)對(duì)固定化生物吸附劑吸附Cd(Ⅱ)的影響較小，而Ca2+在較高濃度時(shí)對(duì)固定化生物吸附劑吸附Cd(Ⅱ)產(chǎn)生了一定的影響，這可能是由于Ca2+是正二價(jià)金屬離子易于侵占吸附劑上Cd(Ⅱ)的結(jié)合位點(diǎn)造成的。在加入Zn(Ⅱ)后，Zn(Ⅱ)濃度在20～60mg/L時(shí)對(duì)固定化生物吸附劑吸附Cd(Ⅱ)基本無(wú)影響。Zn(Ⅱ)濃度為80～100mg/L時(shí)，Cd(Ⅱ)去除率下降了6%±0.5%，因此當(dāng)Zn(Ⅱ)濃度低于80mg/L的情況下固定化微生物活性小球?qū)d(Ⅱ)的吸附影響較小。

圖12 常見(jiàn)陽(yáng)離子對(duì)Cd(Ⅱ)吸附效果的影響

3 結(jié)論

（1）經(jīng)過(guò)重金屬濃度梯度篩選，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)其中菌種豐富度進(jìn)行分析，菌種豐度順序?yàn)長(zhǎng)actococcus＜Stenotrophomonas＜Serratia＜Pseudomonas，通過(guò)文獻(xiàn)分析均對(duì)Cd(Ⅱ)有較好的耐受性和吸附能力。

（2）本研究所用生物吸附劑對(duì)Cd(Ⅱ)有較好的吸附性能，其最佳吸附條件為pH=4～5，吸附時(shí)間48h，吸附劑用量（濕重）50g/L，Cd(Ⅱ)初始濃度100mg/L，對(duì)Cd(Ⅱ)的最大去除率可達(dá)91%±2%。

（3）本文中的生物吸附劑對(duì)Cd(Ⅱ)的吸附過(guò)程更加符合準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)和Langmuir模型，影響吸附反應(yīng)的主要原因是化學(xué)鍵的形成，對(duì)Cd(Ⅱ)的最大單分子層吸附量為34.4mg/g。通過(guò)BET分析顯示材料具有介孔結(jié)構(gòu)、比表面積豐富，有利于吸附作用的進(jìn)行。FTIR-ATR結(jié)果說(shuō)明材料具有豐富的重金屬結(jié)合點(diǎn)位，—COOH、—OH、—NH、—CH基團(tuán)參與了Cd(Ⅱ)的吸附過(guò)程。

（4）通過(guò)吸附解析得到生物吸附劑重復(fù)使用3次仍能保持較好的吸附效果，具有較高的經(jīng)濟(jì)實(shí)用性；水環(huán)境中常見(jiàn)陽(yáng)離子對(duì)Cd(Ⅱ)的競(jìng)爭(zhēng)吸附結(jié)果顯示出其對(duì)Cd(Ⅱ)吸附影響的大小順序依次為Na+＜K+＜Ca2+。

綜上所述，通過(guò)將重金屬污染的原位混合微生物進(jìn)行重金屬濃度梯度篩選后，再以包埋固定化方式制備的生物吸附劑對(duì)水環(huán)境中重金屬離子的去除具有良好的效果。