張文波，王亞靜，蘇 晨，董 燕，候倩茹，耿騰飛

(西安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，西安 710061)

繡球(Hydrangeamacrophylla)屬繡球科繡球?qū)俣嗄晟鷣喒嗄?、灌木或小喬木狀珍貴木本花卉[1]，又名山繡球、八仙花、紫陽花，原產(chǎn)于我國，主要分布于華東、華中、云南、廣西等地區(qū)，具有花大、花色艷麗、花期長、觀賞價值高等特點。喜溫暖、濕潤、散射光或半陰環(huán)境，生長適溫為18～28 ℃，超過30 ℃時會出現(xiàn)不良影響。1789年，Joseph Banks把繡球從中國引入英國以后，立即成為世界各國備受歡迎的園藝觀賞植物[2]。全世界繡球?qū)俅蠹s有73個種，中國有47個種和11個變種[3]，在這些品種中缺乏抗強光照及抗熱性表現(xiàn)好的品種，限制了繡球花在園林方面的應(yīng)用。國內(nèi)近幾年對繡球花雜交育種的研究越來越多，但是繡球花的雜交種子存在一定程度的胚敗育現(xiàn)象，導(dǎo)致雜交種子萌發(fā)率低，影響了育種進程。作者試圖通過建立石蠟切片關(guān)鍵技術(shù)，進一步了解繡球花種子發(fā)生發(fā)育過程，為研究胚敗育機理奠定基礎(chǔ)，加快育種進程，以增大園林綠化花卉種類的選擇和利用。

石蠟切片是一種非常經(jīng)典的顯微制片方法，由于其易操作、切片薄、能夠形成連續(xù)蠟帶等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于比較解剖學(xué)、發(fā)育解剖學(xué)、生理解剖學(xué)等。目前繡球花果實石蠟切片的制作技術(shù)尚不明確。因此，本研究擬探索繡球花果實的一般石蠟制片流程，以期為繡球花果實石蠟制片技術(shù)提供參考,以便借助切片能更直觀地觀察種子發(fā)育情況。

1 材料與方法

1.1 實驗時間、地點

采樣時間為2019年12月16日，實驗于2020年1月中旬至2月在西安市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技展示中心實驗室進行。

1.2 實驗材料

在西安市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技展示中心花卉種植棚剪取生長174 d的繡球花果實。

1.3 實驗方法

1.3.1 繡球果實及種子形態(tài)特征的觀察 選取典型的繡球花果實30粒，用OLYMPUS SZX16體視顯微鏡觀察果實的外形，利用游標(biāo)卡尺測量其大小并記錄。

1.3.2 繡球果實石蠟切片及觀察

(1)固定

向2 ml離心管中分別加入1 mL FAA固定液(70%乙醇90 mL、冰醋酸5 mL、甲醛5 mL)，固定3 d。

(2)脫水、透明

固定后的材料依次在75%、85%、90%、95%乙醇以及兩次無水乙醇中脫水4、2、2、1 h，30、30 min，然后在1/2無水乙醇+1/2二甲苯混合液、100%二甲苯、100%二甲苯中分別逐級透明10 min。

(3)浸蠟與包埋

在放置有材料及二甲苯的小瓶中加入1/4體積的碎蠟，將其置于38 ℃恒溫箱中浸蠟；12 h后溫度設(shè)置為48 ℃，并用一次性塑料滴管吸出1/4體積混合液，繼而再加入1/4體積的純凈石蠟；再經(jīng)12 h溫度設(shè)置為58 ℃，同樣吸出1/4體積混合液，再加入1/4體積的純凈石蠟，重復(fù)2次，每次12 h。最后轉(zhuǎn)入30 mL陶瓷蠟杯，換3次純凈液體石蠟，每次滲蠟3 h。依包埋材料數(shù)量將A4紙裁成適宜大小后疊成包埋盒，用自來水稍微蘸濕包埋盒底部后，倒入融化的石蠟進行包埋。

(4)切片、粘片與烤片

將蠟塊修成立方體粘于小木塊后切片，切片厚度為4 μm。切片漂浮于攤片機40 ℃溫水上將組織展平，載玻片將組織撈起，60 ℃烘箱內(nèi)烤片。水烤干蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

(5)脫蠟與染色

將烘干的切片依次放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、75%酒精5 min，純水洗。將脫蠟復(fù)水后的切片放入1%番紅染色液中染色2 h，自來水稍洗，洗去多余染料即可。切片依次放入50%、70%、80%梯度酒精中各3～8 s進行脫色。將切片放入固綠染色液中染色6～20 s，無水乙醇三缸脫水。切片入干凈的二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

2 結(jié)果

從圖1A看到果實表面光滑且呈黃綠色圓錐形，在其頂端有四個柱頭，花托整個包裹著果實，花托表面有縱向微突起的果棱。果實長徑3.02～5.24 mm，短徑2.10～3.72 mm，厚度為2.27～3.52 mm。從圖1B看到種子外形似葵花子仁，細長、頂端稍尖，還具有不規(guī)則的網(wǎng)狀紋理。

圖1 繡球果實及種子的形態(tài)

從圖2看到試驗所制切片形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整，圖像干凈清晰。從制片中可以觀察到果實主要由外果皮、果肉、內(nèi)果皮及種子組成，果實最外側(cè)是一層排列緊密的外果皮表皮細胞，局部表皮細胞木栓化被染成紅褐色，表皮向內(nèi)為膨大的果肉薄壁細胞，果肉中分布有維管束，維管束中的木質(zhì)部被染成紅色，韌皮部被染成藍綠色。內(nèi)果皮有兩層木質(zhì)化的細胞組成，從切片可以看到種子呈細長形，種皮細胞木質(zhì)化被染成鮮紅色，種子緊挨著兩側(cè)內(nèi)果皮分散排列。

圖2 繡球果實的石蠟切片(縱切)

3 討論

生產(chǎn)上，繡球采用扦插擴繁，這種方式周期短且能保持母株優(yōu)良性狀，但是繡球易患病毒病，如果扦插母株患病，容易造成病毒病的積累傳播，且病毒目前無有效防治方法。采用種子擴繁就可避免病毒病的積累，因此有必要對繡球花果實進行解剖觀察和鑒定，以掌握種子的發(fā)育規(guī)律，這對繡球花的生產(chǎn)具有重要現(xiàn)實意義。

從生長了170 d的果實來看，種皮已木質(zhì)化，且大部分種子已經(jīng)從胎座上脫落下來，說明種子已經(jīng)接近成熟期。一般胚敗育發(fā)生在種子發(fā)育的中后期，所以我們可以通過石蠟切片觀察，以判定種子發(fā)育的時期，盡早制定胚拯救方案。另外，從授粉到果實成熟，果實和種子在發(fā)育過程中的完整形態(tài)變化還需要我們通過進一步的分階段采樣，以精確判定種子的發(fā)育時期，為胚拯救奠定基礎(chǔ)。

眾所周知，果實中分布有維管系統(tǒng)，維管束是果實水分和營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)闹饕ǖ?在種子發(fā)育期間,水分、無機鹽和有機物等物質(zhì)通過維管系統(tǒng), 從果實胎座被輸送到胚乳和胚, 供胚乳和胚發(fā)育與貯藏。胚敗育是否與維管系統(tǒng)有關(guān)，這還需要我們進一步對果實發(fā)育過程中的維管系統(tǒng)進行解剖分析。