陳鋒 章曉云,* 陳躍平 李華南 甘斌 陳丁鵬 宋世雷 廖建釗

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011 2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是一種全身性、代謝性骨骼疾病，以骨量減少、骨脆性增加、骨強(qiáng)度降低及骨組織微觀結(jié)構(gòu)破壞為主要特征[1]。臨床以抑制破骨、促進(jìn)成骨和鈣化等為主要原則，然而單純采用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療OP存在毒副作用多、難以有效調(diào)控骨代謝動(dòng)態(tài)平衡等問題，其治療效果并不理想[2]。隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展，其在OP的預(yù)防和治療等方面取得良好效果，中藥抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制逐步進(jìn)入研究者的視野[3]。

骨碎補(bǔ)和淫羊藿是中醫(yī)治療骨傷科疾病的傳統(tǒng)藥對(duì)，已廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的治療過程中，現(xiàn)代研究表明二者的提取物具有增加骨密度，促進(jìn)成骨分化、抑制破骨活動(dòng)和改善骨組織微觀結(jié)構(gòu)的作用[4-5]。但骨碎補(bǔ)和淫羊藿的活性成分眾多，作用靶點(diǎn)豐富，分子機(jī)制尚不明確?；诖耍狙芯坷镁W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)從分子水平探討“骨碎補(bǔ)-淫羊藿”治療OP的具體作用機(jī)制，以期為下一步深入研究提供方向和參考。

1 材料與方法

1.1 活性成分篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)，以“骨碎補(bǔ)”“淫羊藿”為關(guān)鍵詞檢索化學(xué)成分。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件在TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選出2味中藥的活性成分，最終確定活性成分集合。

1.2 靶標(biāo)蛋白篩選

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫對(duì)篩選出的活性成分進(jìn)行檢索，查找與之對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白，并運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫查詢靶標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)的基因名，將得到的靶基因名進(jìn)行合并及刪除重復(fù)項(xiàng)，最終所得結(jié)果即為“骨碎補(bǔ)-淫羊藿”活性成分的靶點(diǎn)。

1.3 篩選OP作用靶點(diǎn)

在GEO數(shù)據(jù)庫中檢索與OP相關(guān)的芯片，獲得編號(hào)為GSE56116的矩陣文件和GPL4133基因注釋文件，該芯片中包含13個(gè)血液樣本，其中OP患者10例，健康對(duì)照3例。利用R語言對(duì)其進(jìn)行基因重注釋、分類和校正，limma包分析差異基因，并設(shè)置差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)>0.5，P<0.05；最后運(yùn)用pheatmap包對(duì)差異基因繪制熱圖。

1.4 “單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在藥物作用的靶點(diǎn)和疾病的差異基因之間取交集，以交集基因?yàn)闃蛄?，整合交集基因所?duì)應(yīng)的藥物活性成分，獲取“骨碎補(bǔ)-淫羊藿”治療OP的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)入到 Cytoscape3.7.2軟件中，構(gòu)建“單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集基因?qū)隒ytoscape軟件中的Bisogenet插件，限定研究物種為“Homo Sapiens”獲得蛋白互作關(guān)系，并運(yùn)用CytoNCA插件設(shè)置DC>61和BC>58，篩選富集程度高的蛋白互作關(guān)系，構(gòu)建PPI核心網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對(duì)接

利用Chem Office軟件制作關(guān)鍵化合物的3D結(jié)構(gòu)，再從PDB數(shù)據(jù)庫下載核心蛋白基因的3D結(jié)構(gòu)，利用PyMOL軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行去水、去磷酸根等操作，利用Auto Dock1.5.6軟件將化合物及核心蛋白基因pdb格式轉(zhuǎn)為pdbqt格式并尋找活性口袋，最后運(yùn)行Vina進(jìn)行對(duì)接。根據(jù)結(jié)合能大小來評(píng)估二者的結(jié)合活性，選取結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol作為篩選依據(jù)，以評(píng)價(jià)網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測(cè)的可靠性。

1.7 GO與KEGG分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行GO功能富集分析，研究“骨碎補(bǔ)-淫羊藿”治療OP的主要生物功能；對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，研究“骨碎補(bǔ)-淫羊藿”治療OP的主要信號(hào)通路，P<0.05代表富集結(jié)果顯著。最后利用R語言繪制GO和KEGG富集分析氣泡圖。

1.8 KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)步驟1.7所得的信號(hào)通路，分析每條信號(hào)通路所調(diào)控的差異基因，獲得通路與基因的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。將該網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape中，選取前15條通路繪制“KEGG信號(hào)通路-差異基因”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共獲得化學(xué)成分261個(gè)，再以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為過濾條件對(duì)其進(jìn)行篩選，共得到41個(gè)活性成分(骨碎補(bǔ)18個(gè)、淫羊藿23個(gè))。其中有2個(gè)交集化合物，刪除重復(fù)項(xiàng)后剩余39個(gè)活性成分，基本信息見表1。

表1 “骨碎補(bǔ)-淫羊藿”活性成分基本信息Table 1 Basic information of active components in drynariae rhizoma-epimedii folium

2.2 OP作用靶點(diǎn)的篩選

利用R語言對(duì)芯片進(jìn)行分析，共得到971個(gè)明顯改變的基因，其中上調(diào)基因541個(gè)，下調(diào)基因430個(gè)。在上調(diào)和下調(diào)的基因中分別選取前20個(gè)繪制差異基因熱圖，見圖1。圖中前3列為健康對(duì)照組的基因，后10列為OP患者的基因，顏色則代表該基因在不同樣品中表達(dá)的程度，綠色代表低表達(dá)，黑色代表中表達(dá)，紅色代表高表達(dá)。而在整組差異基因中，變異程度越高，對(duì)OP發(fā)生發(fā)展造成影響的可能性越大。變異程度最高的蛋白基因?yàn)镃YP1B1、UBR7、SERPINA6、ANPEP、TMEM51。

2.3 “單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

藥物作用的靶點(diǎn)基因和疾病的差異基因之間共存在17個(gè)交集基因，整合交集基因所對(duì)應(yīng)的活性成分，構(gòu)建“骨碎補(bǔ)-淫羊藿”治療OP的“單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5位的化合物分別是槲皮黃素、山柰酚、木犀草素、淫羊藿苷元、豆甾醇，其基本信息見表2。

圖2 單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Single drug-active component-target network

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)浞治?/h3>

利用Cytoscape軟件的Bisogenet和CytoNCA插件構(gòu)建PPI核心網(wǎng)絡(luò)，其過程見圖3。結(jié)果顯示度值排名前5的蛋白基因?yàn)镋SR1、PRKDC、HSPA8、EP300和HSP90AA1，這些度值較大的蛋白基因在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用，可能是治療OP的關(guān)鍵靶點(diǎn)，其基本信息見表3。

2.5 分子對(duì)接

以結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)關(guān)鍵活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證(PRKDC由于缺少相應(yīng)的配體結(jié)構(gòu)未能與關(guān)鍵活性成分進(jìn)行對(duì)接)。結(jié)果顯示二者對(duì)接的親和力遠(yuǎn)小于-5.0 kJ/mol，由此表明關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)間具有較好的結(jié)合活性，證明該研究的預(yù)測(cè)較為可靠，結(jié)果見表4。選取親和力最低的木犀草素和ESR1進(jìn)行分子對(duì)接展示，見圖4。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鯢ig.3 Network topology analysis of PPI

表2 關(guān)鍵化合物的基本信息Table 2 The basic information on the key compounds

2.6 GO和KEGG分析

GO富集分析共得到68個(gè)條目，其中生物過程59個(gè)、細(xì)胞成分5個(gè)、分子功能4個(gè)；KEGG富集分析共得到15條通路，根據(jù)P排序，選取富集最顯著析結(jié)果顯示，“骨碎補(bǔ)-淫羊藿”治療OP主要包括異源代謝、固醇代謝、破骨細(xì)胞分化的調(diào)控等生物學(xué)過程，涉及MAPK、NF-κB、PI3K-AKT及HIF-1等信號(hào)通路。

表3 關(guān)鍵靶點(diǎn)的基本信息Table 3 The basic information of the key targets

表4 關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接的結(jié)合能

圖4 木犀草素和ESR1的分子對(duì)接圖Fig.4 Molecular docking diagram of luteolin and ESR1

圖5 GO和KEGG信號(hào)通路可視化結(jié)果Fig.5 Visualization results of GO and KEGG signaling pathways

的10個(gè)條目以氣泡圖形式展現(xiàn)(不足則選取全部)，見圖5。圖中橫坐標(biāo)為該通路富集的基因占人體總基因的比例，氣泡越大代表該通路富集的基因數(shù)越多，顏色越紅則代表富集程度越顯著。分

2.7 KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Cytoscape軟件對(duì)靶點(diǎn)-信號(hào)通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建“KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖”，見圖6。內(nèi)圈長方形代表基因，外圈三角形代表KEGG信號(hào)通路，如果KEGG信號(hào)通路和基因之間有連線則說明該基因?qū)儆谶@條通路，圖形越大則代表連接節(jié)點(diǎn)越多。結(jié)果顯示“骨碎補(bǔ)-淫羊藿”的各有效成分是通過多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路共同起到治療OP的作用。

圖6 KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Diagram of KEGG network

3 討論

中醫(yī)學(xué)將OP歸為“骨痿”“骨枯”等范疇，認(rèn)為OP的發(fā)病以腎虛為本，臨床治療上以補(bǔ)腎壯骨、益精填髓為主[6]。骨碎補(bǔ)和淫羊藿是骨傷科常用藥物，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨等功效[7]，兩者經(jīng)常組成藥對(duì)出現(xiàn)在治療OP的藥方中，但其藥理機(jī)制尚未清楚。因此運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)探討二者聯(lián)用下的藥理機(jī)制。

單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)顯示“骨碎補(bǔ)-淫羊藿”治療OP具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，結(jié)果顯示槲皮黃素、山柰酚、木犀草素、淫羊藿苷元、豆甾醇等是其關(guān)鍵有效成分。研究證實(shí)槲皮黃素可通過作用于ERK通路抑制脂肪干細(xì)胞增殖并促進(jìn)其成骨分化[8]，而山奈酚可增加骨密度、改善骨微結(jié)構(gòu)，能有效治療OP[9]。另有研究顯示木犀草素不僅能減少破骨細(xì)胞形成，還可降低其骨吸收能力[10]。淫羊藿苷元具有促骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用[11]。豆甾醇具有抗氧化作用，能抑制軟骨降解，具有治療OP的潛力[12]。除豆甾醇之外，其他4種活性成分均屬黃酮類藥物，該類藥物與雌激素在體內(nèi)的功效高度相似，具有促進(jìn)成骨、抑制破骨等作用，且毒副作用小，可開發(fā)為有效防治OP的藥物[13]。且從圖2可以看出，豆甾醇可單獨(dú)作用于靶點(diǎn)ADRA1B，槲皮黃素可單獨(dú)作用于靶點(diǎn)FOS，而二者又可共同作用于靶點(diǎn)RXRA。故筆者認(rèn)為“骨碎補(bǔ)-淫羊藿”各有效成分之間存在緊密的協(xié)同作用，是治療OP的關(guān)鍵有效成分。

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)表明ESR1、PRKDC、HSPA8、EP300和HSP90AA1可能是“骨碎補(bǔ)-淫羊藿”治療OP的關(guān)鍵靶點(diǎn)。ESR1編碼雌激素受體，可與ESR2形成二聚體從而表現(xiàn)出雌激素樣作用[14]。而雌激素的減少不僅會(huì)使成骨細(xì)胞數(shù)目減少，活性降低，更會(huì)讓破骨細(xì)胞凋亡受抑制，從而誘發(fā)OP[15]。PRKDC參與多種細(xì)胞途徑，其表達(dá)的抑制會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)DNA-DSBs水平增加從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，然而其在上述細(xì)胞途徑中的潛在作用仍不清楚[16]，這就為以后通過作用PRKDC來治療OP的研究提供新的方向和線索。EP300蛋白在細(xì)胞增殖和分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，具有治療OP的潛力[17]。HSPA8與HSP90AA1二者均屬于熱休克蛋白，維持著細(xì)胞蛋白的穩(wěn)態(tài)和正常功能。研究表明通過下調(diào)HSPA8和HSP90AA1能夠調(diào)控MAPK通路中與成骨相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化[18-19]。對(duì)上述靶點(diǎn)分析表明，通過作用這些靶點(diǎn)有望達(dá)到治療OP的目的。

GO富集分析顯示“骨碎補(bǔ)-淫羊藿”治療OP的基因功能主要體現(xiàn)在異源代謝、固醇代謝、破骨細(xì)胞分化的調(diào)控等過程，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[20]。KEGG信號(hào)通路主要富集在MAPK、NF-κB、PI3K-AKT及HIF-1信號(hào)通路。①M(fèi)APK信號(hào)通路：MAPK是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，調(diào)控成骨細(xì)胞生長和分化，在抑制骨吸收、促進(jìn)成骨分化等方面發(fā)揮重要作用，對(duì)治療OP意義重大[21]。②NF-κB信號(hào)通路：NF-κB是一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，能夠調(diào)控多種炎癥因子的表達(dá)和細(xì)胞凋亡，在骨形成和骨吸收中起到重要作用。研究證明破骨細(xì)胞在吸收骨組織時(shí)候會(huì)釋放炎癥因子，而通過作用NF-κB信號(hào)通路可明顯抑制破骨細(xì)胞的活動(dòng)、消除機(jī)體的炎癥反應(yīng)[22]。③PI3K-AKT信號(hào)通路：PI3K信號(hào)通路主要調(diào)控體內(nèi)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，PI3K被激活后會(huì)募集下游信號(hào)分子AKT，同時(shí)促進(jìn)mTOR的活化來影響成骨細(xì)胞分化，并抑制其凋亡，對(duì)治療OP有重要指導(dǎo)意義[23]。④HIF-1信號(hào)通路：HIF-1信號(hào)通路是一種典型的低氧反應(yīng)通路，研究表明在骨的生成過程中HIF-1可以調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖和遷移，并對(duì)骨存在保護(hù)效應(yīng)[24]。對(duì)上述通路的分析表明“骨碎補(bǔ)-淫羊藿”主要在成骨、破骨和炎癥等方面發(fā)揮作用，通過作用于此類靶點(diǎn)來調(diào)控骨代謝達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡從而達(dá)到治療OP效果。同時(shí)通過圖6可知，槲皮黃素可通過作用GSTM1、GSTM2等靶點(diǎn)來調(diào)控PI3K-AKT信號(hào)通路；而山柰酚同樣可通過作用GSTM1來調(diào)控PI3K-AKT信號(hào)通路。各有效成分通過多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路共同起到治療OP的作用。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)對(duì)“骨碎補(bǔ)-淫羊藿”治療OP的潛在作用機(jī)制進(jìn)行了分析，結(jié)果表明各有效成分與作用靶點(diǎn)之間不僅存在密切的協(xié)同關(guān)系、良好的結(jié)合活性，而且從側(cè)面反映出中醫(yī)藥治療疾病具有多成分、多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路的特色，與中醫(yī)整體觀念思想不謀而合。這為后續(xù)使用“骨碎補(bǔ)-淫羊藿”進(jìn)行OP的臨床治療提供了重要的理論基礎(chǔ)，但仍需結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，以期闡明其分子作用機(jī)制，促進(jìn)中藥現(xiàn)代化發(fā)展。