門志濤 徐敏 黃承軍 萬雷 馬江濤 黃宏興, 黃紅，*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006 2.柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州 545001 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510378

骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)是指在低能量暴力的情況下引起的骨折，骨質(zhì)疏松癥一旦發(fā)生骨折，其后果往往非常嚴(yán)重，尤其對(duì)一些高齡患者來說，有些部位的骨質(zhì)疏松性骨折可能是致命的打擊，甚至有人稱它為“人生最后一次骨折”。據(jù)2018年10月份國(guó)家衛(wèi)生健康委發(fā)布的有關(guān)骨質(zhì)疏松癥流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國(guó)每年骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率超過9%，呈逐年增高的趨勢(shì)[1]。

目前抗骨質(zhì)疏松的藥物以西藥為主，但西藥胃腸道反應(yīng)較大，存在過敏、癌變風(fēng)險(xiǎn)，以及費(fèi)用比較昂貴等缺點(diǎn)。越來越多的研究表明，中醫(yī)藥對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折不僅可以顯著提高骨量和增加抗骨折能力，而且能夠有效緩解其他合并癥，其對(duì)全身整體的調(diào)節(jié)作用是中醫(yī)藥最佳優(yōu)勢(shì)所在[2]。中藥療法逐漸成為治療骨質(zhì)疏松性骨折安全、有效、價(jià)廉的療法之一，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，有學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用單味中藥有效成分提取物的療效與中藥復(fù)方療效近似，這樣能解決一部分中藥服用劑量大的弊端，同時(shí)還能夠全面地調(diào)節(jié)機(jī)體功能狀態(tài)而達(dá)到治療的目的，為骨質(zhì)疏松性骨折開辟多靶點(diǎn)治療的途徑。

在我國(guó)，杜仲已廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松性骨折的防治。杜仲是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥，屬杜仲科的植物，性味甘、微辛，性溫，中醫(yī)認(rèn)為杜仲具有強(qiáng)筋壯骨、補(bǔ)益肝腎、調(diào)理沖任、固經(jīng)安胎之效[3]。有學(xué)者對(duì)杜仲的有效化學(xué)成分進(jìn)行了深入研究[4]，這些有效成分具有抗骨質(zhì)疏松、高血糖、高血壓等多種藥理作用，而且杜仲有副作用小，價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，但目前針對(duì)杜仲的藥理研究基本上是針對(duì)杜仲提取物，而對(duì)其有效成分、生物活性以及作用機(jī)制的研究不甚明確，一定程度上阻礙其利用和推廣，因此，對(duì)杜仲藥理學(xué)的進(jìn)一步研究意義重大。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)原理及方法[5-6]，篩選鑒定杜仲的有效成分、杜仲治療骨質(zhì)疏松骨折的靶標(biāo)，并對(duì)篩選得出的靶標(biāo)進(jìn)行功能和通路富集分析，為今后骨質(zhì)疏松性骨折的臨床治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)有：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)，2.3(版本)； GeneCards數(shù)據(jù)庫，4.9(版本)；OMIM數(shù)據(jù)庫；Cytoscape軟件，3.7.2(版本)； Bioconductor數(shù)據(jù)庫，3.8(版本)；Perl軟件，5.26.3(版本)；R語言軟件，3.5.3(版本)；UniProt數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1杜仲有效成分篩選和藥物靶點(diǎn)的提?。菏紫壤肨CMSP平臺(tái)，設(shè)置檢索詞為“杜仲”，對(duì)中藥杜仲中所含有的有效成分進(jìn)行篩選，過濾條件[7]為藥物類藥性>0.18(表1)，口服生物利用度>30%。對(duì)相關(guān)有效成分利用Perl軟件進(jìn)行藥物靶點(diǎn)的提取。

1.2.2添加杜仲基因靶標(biāo)名：利用Perl 5.28.1軟件和UniProt數(shù)據(jù)庫為篩選出的基因靶標(biāo)添加靶標(biāo)名。

1.2.3骨質(zhì)疏松性骨折疾病相關(guān)靶點(diǎn)的獲取：利用GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折進(jìn)行疾病靶標(biāo)檢索，檢索詞為“osteoporotic fracture”和“osteoporosis fracture”。

1.2.4構(gòu)建杜仲-骨質(zhì)疏松性骨折靶標(biāo)：應(yīng)用R語言軟件對(duì)中藥杜仲的作用靶標(biāo)和骨質(zhì)疏松性骨折相關(guān)的基因靶標(biāo)取交集處理，獲得杜仲-骨質(zhì)疏松性骨折共同靶標(biāo)的Venny圖(圖1)。

1.2.5中藥-疾病-靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)的建立：利用Perl 5.28.1軟件對(duì)杜仲靶標(biāo)和杜仲-骨質(zhì)疏松性骨折疾病靶標(biāo)進(jìn)行逐一對(duì)應(yīng)，再利用Cytoscape軟件繪制中藥-疾病-靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò)，得到中藥-成分-疾病-靶標(biāo)調(diào)控思維網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。

1.2.6構(gòu)建杜仲-骨質(zhì)疏松性骨折疾病靶標(biāo)蛋白相互作網(wǎng)絡(luò)和篩選關(guān)鍵核心靶標(biāo)：將中藥-疾病靶標(biāo)輸入STRING 11.0在線軟件中，設(shè)置最小互作分?jǐn)?shù)值為0.4，篩選種屬為人，利用軟件自動(dòng)繪制杜仲-骨質(zhì)疏松性骨折疾病靶標(biāo)蛋白相作網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)，并生成數(shù)據(jù)文件結(jié)果，將結(jié)果利用R語言軟件進(jìn)行計(jì)算，得出杜仲-骨質(zhì)疏松性骨折疾病靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵核心靶標(biāo)的柱狀圖(圖4)。

1.2.7GO和KEGG富集分析：對(duì)中藥-疾病靶標(biāo)進(jìn)行“R語言”計(jì)算，得到GO功能富集分析結(jié)果(圖5)和KEGG通路富集分析結(jié)果(圖6)，以P<0.05為閾值。

表1 杜仲有效成分篩選結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 中藥杜仲所含有效成分和靶標(biāo)預(yù)測(cè)的結(jié)果

利用TCMSP計(jì)算系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室對(duì)杜仲的有效成分及其相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)杜仲的有效成分有120個(gè)，獲得相關(guān)靶標(biāo)有1 487個(gè)。通過對(duì)OB和DL參數(shù)進(jìn)行設(shè)置后進(jìn)行人工篩選，結(jié)果得到杜仲的有效成分有28個(gè)，對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)有533個(gè)。

2.2 構(gòu)建的杜仲-骨質(zhì)疏松性骨折疾病靶標(biāo)結(jié)果

得到杜仲-骨質(zhì)疏松性骨折疾病共同靶標(biāo)的Venny圖(圖1)，骨質(zhì)疏松性骨折疾病相關(guān)靶標(biāo)2 231個(gè)，杜仲靶標(biāo)98個(gè)，中藥-疾病靶標(biāo)59個(gè)。

圖1 中藥-疾病靶標(biāo)Fig.1 TCM-disease target

2.3 構(gòu)建的中藥-疾病-靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果

圖2中每個(gè)圓點(diǎn)代表一個(gè)基因或蛋白，圓點(diǎn)間連線顏色的不同代表聯(lián)系，如黃色代表文本挖掘證據(jù)，藍(lán)色代表蛋白同源性證據(jù)等。

圖2 中藥-疾病-靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 The regulatory network of TCM- disease-target

圖3中青色代表骨質(zhì)疏松性骨折，藍(lán)色代表的是中藥-杜仲，紫色代表的是杜仲所含有的有效成分，綠色則代表杜仲-骨質(zhì)疏松性骨折共同的靶標(biāo)。杜仲中有19種有效成分可作用于骨質(zhì)疏松性骨折的59個(gè)基因靶標(biāo)上。

圖3 中藥-疾病靶標(biāo)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The protein-protein interaction network of the TCM-disease target

2.4 構(gòu)建杜仲-骨質(zhì)疏松性骨折疾病靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和篩選關(guān)鍵核心靶標(biāo)的結(jié)果

從圖4中看出，杜仲與骨質(zhì)疏松性骨折疾病核心基因相關(guān)度由高到低依次為：ALB、CASP3、MAPK8、VEGFA、EGFR、ESR1、MYC、CCND1、FOS、AR、CTNNB1、ERBB2、NOS3、PPARG、RELA、NR3C1、AHR、CAV1、PGR、CASP9、HIF1A、ICAM1、CCNB1、CYP3A4、IGF2、PARP1、VCAM1、CRP、ESR2、NFKBIA。

圖4 杜仲-骨質(zhì)疏松性骨折核心靶標(biāo)圖Fig.4 Barplot of eucommiae-OPF core target注：左縱軸為基因名，橫坐標(biāo)數(shù)字為相應(yīng)基因鄰接點(diǎn)數(shù)量，數(shù)值越高，相關(guān)度越高。

圖5 A：GO功能富集分析氣泡圖；B：GO功能富集分析柱狀圖Fig.5 A: Dotplot of GO functional enrichment analysis; B: Barplot of GO functional enrichment analysis

圖6 A：KEGG通路富集分析氣泡圖；B：KEGG通路富集分析柱狀圖Fig.6 A: Dotplot of KEGG pathway enrichment analysis; B: Barplot of KEGG pathway enrichment analysis

2.5 GO功能富集分析

利用GO功能富集分析杜仲治療骨質(zhì)疏松性骨折的關(guān)鍵核心靶標(biāo)的結(jié)果見圖5。杜仲治療骨質(zhì)疏松性骨折的核心基因的GO功能主要涉及核受體的活動(dòng)、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性等。

2.6 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析結(jié)果見圖6，杜仲治療骨質(zhì)疏松性骨折的調(diào)控信號(hào)通路主要涉及：細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-kappaB信號(hào)通路等。

3 討論

近年來越來越多的臨床報(bào)道[8]，杜仲是治療骨質(zhì)疏松性骨折使用頻率較高的單味中藥之一，杜仲能顯著提高骨質(zhì)疏松性骨折的骨密度，提高抗骨折能力，其臨床療效顯著，且無明顯不良反應(yīng)[9-10]，但其機(jī)理尚未明確。本研究數(shù)據(jù)分析表明，杜仲治療骨質(zhì)疏松性骨折有關(guān)的主要有效成分有19種，可通過作用于59個(gè)基因靶標(biāo)，通過細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-kappaB信號(hào)通路等多個(gè)信號(hào)通路達(dá)到治療骨質(zhì)疏松性骨折的目的。

杜仲治療骨質(zhì)疏松性骨折主要的有效化學(xué)成分包括皮樹脂醇、白樺脂酸、beta-谷甾醇、山柰酚、OLIVIL、刺桐靈鹼、刺五加提取物等。已有研究證實(shí)白樺脂酸[11]能夠顯著抑制破骨前體細(xì)胞RAW264.7的分化活性，可作為破骨前體細(xì)胞分化的抑制劑。山奈酚[12]可激活雌激素信號(hào)傳導(dǎo)，然后激活Wnt信號(hào)通路，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。也有研究證實(shí)，山奈酚可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，有效改善去勢(shì)大鼠的骨密度，其作用機(jī)制可能與哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路有關(guān)[13-14]。通過對(duì)杜仲主要有效成分與現(xiàn)已有的對(duì)其相應(yīng)化合物研究結(jié)果進(jìn)行分析比對(duì)，其結(jié)果基本相似，證實(shí)本研究結(jié)果具有較高的可信度。

本研究發(fā)現(xiàn)，杜仲治療骨質(zhì)疏松性骨折的核心基因有ALB、CASP3、MAPK8、VEGFA、EGFR、ESR1、MYC、CCND1、FOS、AR、CTNNB1、ERBB2、NOS3、PPARG、RELA、NR3C1、AHR、CAV1、PGR、CASP9、HIF1A、ICAM1、CCNB1、CYP3A4、IGF2、PARP1、VCAM1、CRP、ESR2、NFKBIA。研究發(fā)現(xiàn)， Casp3的下調(diào)能夠有效地改善高糖抑制的成骨細(xì)胞分化水平，主要通過PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)作用，使成骨細(xì)胞的凋亡降低[15-16]。ESR1在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中表達(dá)，與絕經(jīng)后脊柱骨質(zhì)疏松癥相關(guān)，該基因可作為識(shí)別骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險(xiǎn)增加的指標(biāo)[17]。另外，杜仲治療骨質(zhì)疏松性骨折的過程可能是通過調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等主要信號(hào)通路完成的。比如：PI3K/Akt信號(hào)通路是經(jīng)典的骨代謝穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)信號(hào)通路[18-19]，在骨代謝過程中PI3K/Akt信號(hào)通路是多種因素的主要匯聚點(diǎn)之一。NF-κB信號(hào)通路[20-22]的早期激活對(duì)破骨細(xì)胞的有效形成至關(guān)重要，同樣在破骨細(xì)胞分化的中間階段也起到重要的作用，杜仲可能是通過對(duì)RANKL的反應(yīng)抑制了NF-κB的早期激活，從而發(fā)揮抗破骨作用。MAPK[23-24]信號(hào)通路主要在于對(duì)骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用。有研究表明，MAPK家族成員ERK5在流體剪切力具有顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞分化作用[25]。近現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1在OP大鼠中低表達(dá)，它是通過增強(qiáng)MAPK信號(hào)通路的激活來抑制BMSC的成骨分化，從而促進(jìn)OP進(jìn)程，證實(shí)了MAPK信號(hào)通路與骨質(zhì)疏松性骨折的相關(guān)性[26]。近年來，越來越多的研究證實(shí)，杜仲通過調(diào)節(jié)骨細(xì)胞分化和凋亡的平衡以達(dá)到抗骨質(zhì)疏松的目的，其具有降低破骨細(xì)胞的分化和增殖，而在成骨細(xì)胞中，凋亡被抑制，表明杜仲通過凋亡信號(hào)通路干預(yù)骨質(zhì)疏松的作用[27]。因此，綜合有關(guān)骨質(zhì)疏松性骨折信號(hào)通路的文獻(xiàn)和本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可以推斷出，杜仲可能主要通過細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、NF-kappa B信號(hào)通路等主要信號(hào)通路來調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的各種生理活動(dòng)，達(dá)到治療骨質(zhì)疏松性骨折的目的。

綜上所述，杜仲治療骨質(zhì)疏松性骨折的作用機(jī)制可能是杜仲中19種活性成分調(diào)控骨質(zhì)疏松性骨折相關(guān)的59種基因，通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等多種信號(hào)通路的綜合作用下發(fā)揮治療作用。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法是利用計(jì)算模型為復(fù)雜的治療性化合物提供網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的適應(yīng)證，這項(xiàng)研究的發(fā)現(xiàn)應(yīng)該得到對(duì)照臨床研究和真實(shí)世界證據(jù)的證實(shí)，后期將在此研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)研究，以驗(yàn)證其具體作用機(jī)制。同時(shí)，驗(yàn)證中藥單體治療疾病的同時(shí)，其對(duì)全身的調(diào)節(jié)作用效果有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。