趙怡心 曾繼濤 涂小林 劉宏*

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖健康與不孕癥中心，重慶 400016 2.西南醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，重慶 400016 3.重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院骨發(fā)育與再生實驗室，重慶 400016

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)自被發(fā)現(xiàn)以來，已有大量證據(jù)表明其信號對骨骼、心血管，神經(jīng)系統(tǒng)等的發(fā)育途徑至關(guān)重要。早在19世紀(jì)60年代BMP被發(fā)現(xiàn)及命名以來[1]，BMP逐漸被應(yīng)用于治療骨不連、骨折等疾病[2-4]，生物智能材料也多使用BMP配體作為骨生成的誘導(dǎo)因子[5]，然而目前BMP2、BMP7等僅僅作為治療骨折骨不連藥物，而未被作為增骨藥物使用，其體內(nèi)增骨作用仍未得到證明。此外，隨著BMP大量應(yīng)用于臨床，其副作用如增加傷口引流時間，引起骨過多增長甚至引起骨肉瘤及異位骨化也值得注意[6]，同時也有研究表明BMP作用于成骨細(xì)胞會抑制骨生成[7]。因此如何合理應(yīng)用BMP治療臨床疾病是目前研究熱點。

BMP屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族， 信號的傳導(dǎo)由相關(guān)BMP配體與Ⅰ型受體和Ⅱ型受體組成的受體復(fù)合物結(jié)合，激活下游信號傳導(dǎo)，信號通路主要包括：磷酸化Smad1//5/8與通用smad即Smad4結(jié)合激活的經(jīng)典信號通路及激活MAPK和p38下游的非經(jīng)典信號通路[8]，最后會導(dǎo)致下游靶基因ID1、ID2及其他信號基因的激活[9]。

骨細(xì)胞是骨組織中的主要細(xì)胞，長期包埋于礦化的骨基質(zhì)中，是成骨發(fā)育的終端。早先骨細(xì)胞被認(rèn)為是一種“靜止細(xì)胞”，不影響骨形成及穩(wěn)態(tài)，然而過去的十幾年提供了大量關(guān)于骨細(xì)胞的分子生物學(xué)和功能的研究。骨細(xì)胞具有多種功能，如通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的活性來調(diào)節(jié)骨重建，同時還具有內(nèi)分泌細(xì)胞的功能來調(diào)節(jié)遠(yuǎn)端如腎臟、肌肉等組織器官[10]。敲除骨細(xì)胞中Wnt信號導(dǎo)致小鼠骨形成缺陷等研究表明靶向調(diào)控骨細(xì)胞能夠逆向調(diào)控骨形成，表明骨細(xì)胞中的信號變化能逆向調(diào)控成骨分化過程[11]。

BMP受體特異性激動(FK506)[12]被多項研究證實可以通過結(jié)合FKBP12蛋白從而阻止FKBP12蛋白與BMPR1A受體結(jié)合，從而促進(jìn)BMP信號的傳導(dǎo)[12]。因此筆者利用該藥物激活MLO-Y4骨細(xì)胞中BMP信號，除去藥物對ST2的影響，收集條件培養(yǎng)基進(jìn)行ST2細(xì)胞成骨分化實驗。旨在研究激活骨細(xì)胞中BMP信號對成骨分化及成脂分化的發(fā)育過程的影響，進(jìn)一步了解骨細(xì)胞中BMP對骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化發(fā)育過程的逆向調(diào)控，為骨細(xì)胞靶向治療及藥物研發(fā)提供新的研究基礎(chǔ)材料與方法。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠骨樣細(xì)胞MLO-Y4細(xì)胞系、小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞ST2細(xì)胞由美國Lynda Bonewald教授贈予。αMEM培養(yǎng)基購自美國賽默飛世爾科技公司；胎牛血清購自加拿大Wisent公司；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒均購自上海碧云天生物工程公司。Cell Counting Kit-8 (CCK-8)檢測試劑盒購自美國bimake公司。磷酸化Smad5一抗購自杭州華安生物技術(shù)有限公司；βcatenin一抗購自美國CST公司；二抗購自武漢三鷹生物科技有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購買于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；TrizolRNA抽提液購買于賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1小鼠骨樣細(xì)胞MLO-Y4培養(yǎng)上清的提取：①當(dāng)100 mm培養(yǎng)皿MLO-Y4細(xì)胞達(dá)到80%時，加入DMSO、FK506，分別使DMSO濃度為0.5‰，藥物濃度達(dá)到5 μmol/L，培養(yǎng)24 h；②24 h后，吸棄含有藥物的培養(yǎng)基，PBS液清洗2遍，加入4 mL無血清培養(yǎng)基；③繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清，4 ℃離心，1 200 r/min，5 min；③分裝保存于-80 ℃超低溫冰箱；使用時用新鮮完全培養(yǎng)基稀釋至20%進(jìn)行干預(yù)實驗。

1.2.2堿性磷酸酯酶染色：將ST2細(xì)胞按照4×104/孔接種于24孔板中，在DMSO組、 FK506組分別添加1 mL含0.5‰DMSO的αMEM 完全培養(yǎng)基、含5 μmol/L FK506的αMEM完全培養(yǎng)基。待其生長3 d細(xì)胞進(jìn)行ALP 染色。每組實驗重復(fù)3 次。

1.2.3RNA抽提，逆轉(zhuǎn)錄及qPCR檢測：DMSO和FK506作用MLO-Y4細(xì)胞收集上清，使用時用新鮮完全培養(yǎng)基稀釋至20%作用ST2，培養(yǎng)3 d后，使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，測得RNA濃度后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA。使用測定相應(yīng)目的基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。所有樣本以GAPDH的表達(dá)水平作標(biāo)準(zhǔn)。測定引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1 The primer sequences of qPCR

1.2.4Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測MLO-Y4細(xì)胞活力：將MLO-Y4細(xì)胞以8 000/孔接種于96孔板中，按上述組別分別加入含有0.5‰DMSO、0.5 μmol/L FK506的100 μL體積培養(yǎng)液，24 h后吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗兩遍，每孔加入100 μL新鮮完全培養(yǎng)基及10 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，檢測在波長450 nm處每孔的光密度值(OD值)，按照細(xì)胞活力*(%)=[A(藥物+)-A(空白)] / [A(藥物-)-A(空白)] ×100%計算細(xì)胞活力值。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.5蛋白免疫印跡檢測蛋白表達(dá)：提取蛋白，BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，檢測ST2細(xì)胞中β-catenin、p-smad5的表達(dá)，電泳后，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，敷一抗過夜，洗膜10 min，重復(fù)3次。然后室溫孵育二抗2 h，洗膜3次，每次10 min。最后顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 FK506增強骨細(xì)胞MLO-Y4內(nèi)BMP信號但不影響MLO-Y4活性。

0.5‰DMSO和5 μmol/L FK506作用于MLO-Y4細(xì)胞24 h后，使用CCK8檢測試劑盒檢測24 h后MLO-Y4細(xì)胞活性，與對照組相比，該藥物濃度不會造成MLO-Y4細(xì)胞毒性作用(P>0.05)(圖1A)。qPCR檢測BMP信號靶基因，與對照組相比，F(xiàn)K506組MLOY4細(xì)胞內(nèi)ID1、ID2 mRNA相對表達(dá)量上升(P<0.001)(圖1B)。該結(jié)果提示FK506可以在不影響MLO-Y4細(xì)胞活性的狀態(tài)下激活MLO-Y4細(xì)胞內(nèi)的BMP信號。

圖1 FK506對MLO-Y4細(xì)胞活力及BMP信號靶基因變化的影響A：CCK8檢測細(xì)胞活力圖；B：qPCR檢測BMP信號靶基因ID1，ID2mRNA相對表達(dá)量；注：與DMSO組對比，**P<0.001。Fig.1 Influence of FK506 on MLO-Y4 cell activity and the change of BMP signal target genesA：CCK8 was used to detect cell viability；B：QPCR was used to detect the relative expression of BMP signal target genes Id1 and Id2

2.2 BMP信號激活的MLO-Y4培養(yǎng)上清液增強ST2細(xì)胞ALP活性及成骨礦化

將不同處理組MLO-Y4細(xì)胞培養(yǎng)上清以20%比例混入新鮮完全培養(yǎng)基處理ST2細(xì)胞3 d后，進(jìn)行ALP染色，結(jié)果顯示FK506條件培養(yǎng)基組染色較對照組顏色加深，見圖2。以上結(jié)果提示使用BMP信號激活的MLO-Y4細(xì)胞培養(yǎng)上清促進(jìn)ST2成骨分化。

圖2 MLO-Y4細(xì)胞培養(yǎng)上清作用ST2堿性磷酸酶染色圖(孔板，×200)Fig.2 ALP staining of ST2 cells after cultured with supernatant from MLO-Y4 culture (plate, ×200)

2.3 BMP信號激活的MLO-Y4培養(yǎng)上清液增強ST2細(xì)胞成骨細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)

利用qPCR檢測BMP信號激活的MLO-Y4細(xì)胞培養(yǎng)上清對成骨分化相關(guān)標(biāo)志物ALP、Runx2、OCN、BSP的mRNA表達(dá)變化，結(jié)果顯示，與對照組相比，F(xiàn)K506條件培養(yǎng)基組成骨標(biāo)志物均顯著升高(P<0.001)(圖3)。該結(jié)果與ALP染色結(jié)果均一致，進(jìn)一步證明了BMP信號激活的MLO-Y4細(xì)胞培養(yǎng)上清能夠促進(jìn)ST2成骨分化。

2.4 BMP信號激活的MLO-Y4培養(yǎng)上清液抑制ST2細(xì)胞成脂標(biāo)志物表達(dá)

成脂相關(guān)標(biāo)記基因PPARγ及C/EBP 表達(dá)在各組中也有差異，F(xiàn)K506條件培養(yǎng)基組ST2細(xì)胞PPARγ、C/EBP表達(dá)量均下調(diào)(P<0.001)(圖4)。說明BMP信號增強的MLOY4細(xì)胞上清抑制ST2細(xì)胞成脂分化。

2.5 ST2細(xì)胞內(nèi)Wnt及BMP信號變化

檢測成骨兩個關(guān)鍵信號Wnt信號和BMP信號在ST2細(xì)胞內(nèi)的變化，通過Western blotting確定Wnt信號下游信號β-catenin，BMP信號下游信號磷酸化smad5蛋白表達(dá)差異，β-catenin蛋白表達(dá)量較對照組升高(P<0.05)，p-smad5蛋白表達(dá)量較對照組無顯著性差異(P>0.05)(圖5)。

圖3 qPCR檢測BMP信號激活的MLO-Y4細(xì)胞培養(yǎng)上清對ST2細(xì)胞成骨分化相關(guān)標(biāo)志mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Detection of osteogenic differentiation marker gene in ST2 cells after cultured with supernatant from BMP signal-activated MLO-Y4 culture with qPCR注：與DMSO組對比，**P<0.001。

圖4 ST2細(xì)胞成脂分化標(biāo)志基因檢測Fig.4 Detection of osteogenic differentiation marker gene in ST2 cells注：與DMSO組對比，**P<0.001。

圖5 ST2細(xì)胞內(nèi)β-catenin及p-smad5蛋白水平變化Fig.5 Changes of protein levels of β-catenin and p-smad5 in ST2 cells注：與DMSO組對比，*P<0.05。

3 討論

骨發(fā)育與再生受到多種信號通路調(diào)控，例如Wnt、Notch以及BMP信號等。BMP信號通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡，在機體的發(fā)育和維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前已有多項研究表明BMP信號參與整個骨發(fā)育過程，早期敲除肢體芽間充質(zhì)中的BMPR1A導(dǎo)致小鼠細(xì)胞增殖減少，肢體縮短，幾乎完全不發(fā)育；使用在Prx1-CreERT小鼠模型中敲除間充質(zhì)干細(xì)胞中的BMPR1A發(fā)現(xiàn)小鼠松質(zhì)骨皮質(zhì)骨均降低，提取基因敲除小鼠BMSC發(fā)現(xiàn)其成骨能力降低[13]；但是也有研究發(fā)現(xiàn)使用Col1-Cre系統(tǒng)敲除成骨細(xì)胞中的BMPR1A后，Kamiya等[14]發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞中的BMP信號可以通過上調(diào)Wnt信號抑制劑SOST的表達(dá)來負(fù)向調(diào)控骨量，后期其團(tuán)隊又通過DMP1-Cre敲除小鼠骨細(xì)胞中BMPR1A，發(fā)現(xiàn)小鼠骨量、骨密度和機械強度顯著增加[15]。由此從干細(xì)胞分化發(fā)育到骨細(xì)胞的過程中，BMP都具有一定的調(diào)控作用。但由于在Kamiya團(tuán)隊所使用的DMP1-Cre小鼠的啟動子在骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞均有表達(dá)，并不能分辨骨細(xì)胞在其中扮演的角色，因此骨細(xì)胞中BMP信號的作用研究仍需進(jìn)一步進(jìn)行。

本研究采取體外細(xì)胞實驗，使用小鼠骨細(xì)胞系MLO-Y4細(xì)胞進(jìn)行研究，排除了成骨細(xì)胞的影響，使用BMP信號激動劑FK506激活MLO-Y4細(xì)胞中的BMP信號后，移除藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)上清液，測定其對ST2細(xì)胞成骨分化的影響。由于本實驗使用的DMSO濃度為0.5‰，不影響細(xì)胞的增殖分化因此作為對照組。BMP信號激活的MLO-Y4上清可以促進(jìn)ST2細(xì)胞成骨分化。提示激活BMP信號的骨細(xì)胞可以通過分泌相關(guān)細(xì)胞因子或蛋白作用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞。

為了進(jìn)一步探究ST2細(xì)胞成骨分化的機制，本研究探討了成骨分化過程Wnt信號和BMP信號這兩個重要的關(guān)鍵信號。之前有報道BMP2可以刺激ST2細(xì)胞分泌Wnt5a、Wnt2b、Wnt6[16]，骨細(xì)胞激活BMP信號后是否會產(chǎn)生類似效應(yīng)。本研究通過檢測兩種信號通路下游相關(guān)蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Wnt下游信號β-catenin表達(dá)量上調(diào)，MLO-Y4細(xì)胞BMP信號被激活后會分泌相關(guān)因子，而該因子可以激活ST2細(xì)胞中Wnt信號通路而促進(jìn)其成骨分化。

干細(xì)胞可以向多種類型細(xì)胞分化，從而形成一個完整的個體，包括成骨、成脂分化和成血管分化等。各種分化方向之間受到精密的調(diào)控，此消彼長或相互協(xié)調(diào)。而信號調(diào)節(jié)通常以成骨降低為代價誘導(dǎo)脂肪形成，反之亦然[17]。除了成骨分化發(fā)育方向，骨髓基質(zhì)細(xì)胞還可以朝著成脂方向發(fā)展，本研究檢測了ST2細(xì)胞的成脂標(biāo)志基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)BMP信號激活的MLO-Y4細(xì)胞培養(yǎng)上清抑制ST2細(xì)胞成脂分化標(biāo)志基因的表達(dá)。說明骨細(xì)胞中BMP信號主要促進(jìn)成骨分化，抑制成脂方向分化。

目前，BMP2、BMP7已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用作骨折、骨不連的治療藥物，但是該藥物存在隱患，例如骨增長過多，神經(jīng)病變等并發(fā)癥。同時，BMP的增骨作用并未應(yīng)用于治療骨質(zhì)疏松等全身性骨量降低的疾病，本研究提供了靶向骨細(xì)胞激活其BMP信號促進(jìn)成骨的新策略，為臨床BMP應(yīng)用治療進(jìn)一步發(fā)展提供方向。