陳潔 周錫平 何成松 何躍

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，四川 瀘州 646000 2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，四川 瀘州 646000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征，進(jìn)而引發(fā)的骨密度下降、骨脆性增加和易于骨折的代謝性全身性骨病[1]，已成為我國中老年人群的重要健康問題[2]。成骨細(xì)胞引起的骨形成與破骨細(xì)胞引起的骨吸收間的平衡是維持骨結(jié)構(gòu)完整性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]，成骨細(xì)胞自身特征變化導(dǎo)致骨重建失衡是骨質(zhì)疏松癥的根本原因之一[4]。我國自主研發(fā)的藥物云克注射液其主要成分是锝[99Tc] (A劑)經(jīng)氯化亞錫還原后與亞甲基二膦酸鹽(methylenediphosphonate，MDP)(B劑)形成的螯合物，目前臨床已應(yīng)用于治療骨質(zhì)疏松癥多年，發(fā)現(xiàn)云克可增加骨密度[5-6]，但目前尚無云克對骨質(zhì)疏松癥患者成骨細(xì)胞影響的研究。本研究將觀察云克對體外培養(yǎng)的骨質(zhì)疏松癥患者成骨細(xì)胞增殖分化的影響，為臨床應(yīng)用云克治療骨質(zhì)疏松癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥品與試劑：Ⅰ型膠原酶(美國BD)；0.25% 胰蛋白酶(含EDTA)(美國 Hyclone)；胎牛血清(北京元亨金馬生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，DMEM培養(yǎng)基(高糖型)(美國 Hyclone)； Cell Counting Kit-8試劑盒(日本同仁)；碘化丙啶(美國 Sigma)；Protein Assay Kit(美國Bio-Rad)；堿性磷酸酶檢測試劑盒(南京建成)；云克(成都云克藥業(yè)有限責(zé)任公司)。

1.1.2儀器：SG403TX 生物安全柜(美國 BAKER)；Ckx41 Olympus熒光倒置顯微鏡(日本 Olympus)； Mco-18aic 二氧化碳培養(yǎng)箱(日本 SANYO)；Aria2 流式細(xì)胞儀(美國 BD)；Varioskan Flash 3001連續(xù)波長多功能酶標(biāo)儀(美國 Thermo)。

1.2 方法

1.2.1成骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，骨組織取材于接受髖關(guān)節(jié)置換的骨質(zhì)疏松癥患者，經(jīng)知情同意后取材。充分剝離骨膜及軟組織，無菌PBS液沖洗3次，置于盛有DMEM培養(yǎng)液小瓶中修整成1 mm×1 mm大小的碎塊，再用PBS液多次沖洗，至骨片發(fā)白放入離心管內(nèi)。用Ⅰ型膠原酶消化法獲得成骨細(xì)胞，接種于無菌培養(yǎng)皿中，在5%CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組：藥物干預(yù)組：云克。將A劑(每瓶5 mL，內(nèi)含锝[99Tc](0.05μg)和B劑(MDP 5 mg、氯化亞錫0.5 mg)混合后充分振搖，經(jīng)螯合反應(yīng)后在常溫下靜置5 min，取上述溶液用完全培養(yǎng)液稀釋為10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L(按MDP計(jì))；陰性對照組：完全培養(yǎng)基。

1.2.3觀察云克對成骨細(xì)胞增殖的影響：①CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖。成骨細(xì)胞以2.5×103/孔接種于96孔板(每孔100 μL)，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 4 h后分別加入云克(濃度為10-5mol/L～10-9mol/L)和陰性對照，每組5個(gè)復(fù)孔。于干預(yù)后48 h測定。倒掉培養(yǎng)基，PBS洗2次，向每孔加入100 μL的新鮮DMEM培養(yǎng)基和10 μL的CCK-8溶液；空白孔加入100 μL的新鮮DMEM培養(yǎng)基和10 μL的CCK-8溶液作空白對照，將培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2孵箱中孵育3 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度(OD)，參比波長650 nm。記錄結(jié)果。②流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。成骨細(xì)胞以4×105/皿接種于100 mm培養(yǎng)皿，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后加入云克(終濃度為10-8mol/L)和陰性對照，每組3個(gè)重復(fù)。于干預(yù)后48 h用胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌，1 000 r/min 5 min離心后棄上清，緩慢加入1 mL預(yù)冷70%的無水乙醇，輕柔混勻，制成細(xì)胞懸液，4 ℃固定過夜，1 000 r/min 5 min離心后棄上清，加入3 mL PBS重懸細(xì)胞5 min，400目篩網(wǎng)過濾1次，離心后棄上清，加入PI染液 1 mL，4 ℃、避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測G0/G1、S、G2/M各期細(xì)胞數(shù)。激發(fā)光與接受光波長分別為488 nm，每個(gè)樣本收集3×104個(gè)細(xì)胞。使用Modfit軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和結(jié)果分析，計(jì)算細(xì)胞周期分布。

1.2.4觀察云克對成骨細(xì)胞分化功能的影響：①堿性磷酸酶(ALP)活性測定。成骨細(xì)胞以5×104/孔接種于12孔培養(yǎng)板，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后加入云克(終濃度為10-5mol/L～10-9mol/L)和陰性對照，每組3個(gè)重復(fù)。于加藥后3 d收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液80μL4℃震蕩裂解半小時(shí)，離心收集上清。于96孔板中依次加入上述溶液，每孔各30 μL，用ALP試劑盒(對硝基苯磷酸鹽法，PNPP)按說明進(jìn)行檢測，酶標(biāo)儀測定反應(yīng)后溶液的吸光度(波長為520 nm)，再用考馬斯亮藍(lán)法測定樣本中蛋白質(zhì)含量，以U/mg蛋白質(zhì)表示ALP活性，結(jié)果與對照組比較。②礦化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)。成骨細(xì)胞以1×104/孔接種于24孔培養(yǎng)板，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后加入云克(終濃度為10-8mol/L)和陰性對照，每組3個(gè)重復(fù)。每48 h更換培養(yǎng)液1次。14 d加入含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50 mg/L 抗壞血酸的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)板用PBS沖洗，2.5%戊二醛室溫固定15 min，PBS(pH 4.2)沖洗，2%茜素紅37 ℃孵育10 min，PBS(pH 4.2)沖洗，顯微鏡下觀察。用有格(0.2 mm×0.2 mm)滌綸薄膜貼附于培養(yǎng)板底部，以橘紅色結(jié)節(jié)、邊界清晰、>200 μm為標(biāo)準(zhǔn)，在40倍光鏡下作結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)。

1.2.5Real-time RT-PCR檢測骨鈣素(OC) mRNA和骨形成蛋白(BMP)-2 mRNA的表達(dá)：成骨細(xì)胞以1×105/孔接種于6孔培養(yǎng)板，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后加入云克(終濃度為10-8mol/L)和陰性對照，每組3個(gè)重復(fù)，于干預(yù)后72 h收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。RNA 提取采用TRIzol試劑盒提取 RNA。采用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用以下兩步法PCR反應(yīng)程序進(jìn)行Real Time PCR：預(yù)變性：94℃×120 s，循環(huán)數(shù)為1；PCR反應(yīng)：94℃×20 s，58℃(OC)/54℃(BMP-2)/50℃(GAPDH)×20 s，72℃×40 s循環(huán)數(shù)為45。采用2-△△CT相對定量法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。GAPDH作為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 云克對成骨細(xì)胞增殖的影響

2.1.1CCK-8法檢測細(xì)胞增殖：10-5mol/L～10-9mol/L云克組對成骨細(xì)胞均有促進(jìn)增殖的作用，以10-8mol/L組達(dá)高峰，各組與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明云克在此濃度范圍下有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用(圖1)。

圖1 云克對成骨細(xì)胞增殖的影響(各組與陰性對照比較，*P<0.05)Fig.1 Effect of Yunke on the proliferation of OB (*P<0.05 over control)

2.1.2云克對成骨細(xì)胞周期的影響：10-8mol/L濃度的云克作用下，成骨細(xì)胞S期細(xì)胞(S-phase fraction，SPF)明顯增多，與陰性對照相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；G2/M期細(xì)胞略有增多，但與陰性對照相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；G0/G1期細(xì)胞明顯減少，與陰性對照相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)明顯增高(P<0.05)(圖2)。

2.2 云克對成骨細(xì)胞分化功能的影響

2.2.1ALP活性測定：結(jié)果顯示，10-5mol/L～10-9mol/L云克組對成骨細(xì)胞ALP活性均有促進(jìn)作用，以10-8mol/L組最明顯，各組與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明云克在此濃度下對成骨細(xì)胞ALP活性有促進(jìn)作用(圖3)。

2.2.2礦化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)：10-8mol/L濃度的云克作用下，成骨細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)數(shù)量增多，與陰性對照相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

2.3 骨鈣素mRNA和BMP-2 mRNA的表達(dá)情況

經(jīng)Real-time PCR檢測，10-8mol/L濃度的云克作用下，成骨細(xì)胞骨鈣素mRNA表達(dá)較陰性對照稍有增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖5A)；BMP-2 mRNA表達(dá)較陰性對照明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5B)。

3 討論

云克注射液是中國核動(dòng)力研究設(shè)計(jì)院成都同位素應(yīng)用研究所自主研發(fā)的世界首創(chuàng)的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥等多種骨破壞性疾病的核素藥物，其主要成分是锝[99Tc] (A劑)經(jīng)氯化亞錫還原后與亞甲基二膦酸鹽(B劑)形成的螯合物[7]。為防止分解，制成A劑人工微量元素溶液，B劑為注射用亞錫亞甲基二膦酸鹽凍干粉，混合后充分振搖，經(jīng)螯合反應(yīng)后在常溫下靜置5 min作靜脈注射。研究發(fā)現(xiàn)云克有多種藥理作用，包括抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫及對骨代謝的調(diào)節(jié)作用等，當(dāng)云克進(jìn)入關(guān)節(jié)腔到達(dá)滑膜炎癥部位或異常的骨骼區(qū)域時(shí)，即與該處未成熟的膠原結(jié)合或被羥基磷灰石結(jié)晶吸附，這樣能較長時(shí)間發(fā)揮藥物的物理和化學(xué)效應(yīng)，起到治療作用[7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)云克注射液對糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松大鼠有治療作用[8]。臨床運(yùn)用發(fā)現(xiàn)云克注射液可提高骨質(zhì)疏松癥患者骨密度，并有良好的安全性[6]。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測云克對成骨細(xì)胞細(xì)胞周期的影響(各組與陰性對照比較，*P<0.05)Fig.2 Effect of Yunke on cell cycle of OB detected with flow cytometry(*P<0.05 over control)

圖3 PNPP法檢測云克對成骨細(xì)胞ALP活性的影響(各組與陰性對照比較，*P<0.05)Fig.3 Effect of Yunke on ALP activity of osteoblast detected with PNPP assay(*P<0.05 over control)

成骨細(xì)胞的主要作用是形成骨基質(zhì)和調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的骨吸收，在骨形成、骨構(gòu)塑(bone modeling)與骨重建(bone remodeling)中起重要作用。成骨細(xì)胞的分化過程由細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)形成及成熟、骨基質(zhì)礦化3個(gè)階段組成。在細(xì)胞增殖階段，I型膠原達(dá)最高峰，產(chǎn)生大量骨基質(zhì)，為骨基質(zhì)成熟和礦化提供基質(zhì)網(wǎng)架；在骨基質(zhì)成熟期，細(xì)胞增殖減弱，ALP活性增高達(dá)最高，表明骨基質(zhì)成熟；骨基質(zhì)礦化階段，ALP活性逐漸下降，骨鈣素基因的表達(dá)明顯增加，細(xì)胞有多個(gè)骨結(jié)節(jié)形成，進(jìn)入骨基質(zhì)礦化階段[9]。因此，對骨形成促進(jìn)藥物的體外細(xì)胞藥效可從OB的增殖功能和分化功能來評(píng)價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)首先檢測細(xì)胞的增殖功能，結(jié)果顯示云克在10-5mol/L～10-9mol/L濃度下有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用。然后通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在10-8mol/L濃度下，云克可使成骨細(xì)胞S期細(xì)胞明顯增多(P<0.05)，細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)明顯增高(P<0.05)，進(jìn)一步說明了云克有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用。

圖4 茜素紅染色檢測云克對成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的影響(各組與陰性對照比較，*P<0.05)Fig.4 Effect of Yunke on mineralized nodules in OB detected with Alizarin red staining(*P<0.05 over control)

圖5 云克對成骨細(xì)胞骨鈣素和BMP-2 mRNA表達(dá)的影響(各組與陰性對照比較，*P<0.05)Fig.5 Effect of Yunke on mRNA expression of OC and BMP-2 in OB(*P<0.05 over control)

ALP為成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志，其活性越高說明前成骨細(xì)胞向成熟成骨細(xì)胞分化越明顯[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示云克在10-5mol/L～10-9mol/L濃度下對成骨細(xì)胞ALP活性有明顯促進(jìn)作用，說明云克有促進(jìn)成骨細(xì)胞向成熟成骨細(xì)胞分化的作用。礦化結(jié)節(jié)形成代表了成骨細(xì)胞分化成熟，是成骨功能的形態(tài)表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示10-8mol/L濃度的云克有促進(jìn)成骨細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的作用。

骨形成蛋白2(bone morphogenetic proteins，BMP-2)屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員，具有良好的異位誘導(dǎo)成骨作用，是BMP家族中誘骨活性最強(qiáng)的一種，也是唯一能單獨(dú)誘導(dǎo)成骨的細(xì)胞因子[11]。研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)細(xì)胞比原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞具有更好的成骨分化能力[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10-8mol/L濃度的云克可明顯促進(jìn)BMP-2 mRNA表達(dá)(P<0.05)。

骨鈣素是成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志，反映成骨細(xì)胞的成骨功能[13]。由于細(xì)胞培養(yǎng)液中含骨鈣素太少，所以對骨鈣素mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，以反映骨鈣素表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，云克組骨鈣素mRNA表達(dá)較陰性對照有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這可能是由于骨鈣素表達(dá)高峰是在骨形成的晚期骨基質(zhì)礦化階段，而本研究對細(xì)胞進(jìn)行檢測的的時(shí)間尚處于骨形成的早期，所以推測這可能是骨鈣素mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯增高的原因，在以后的實(shí)驗(yàn)中將就此問題進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

綜上所述，云克能促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥患者成骨細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)成熟的成骨細(xì)胞特異性分泌骨形成所需的ALP和BMP-2，提高骨質(zhì)疏松癥患者成骨細(xì)胞骨形成的功能，這可能是云克治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制之一。