王劍 豐雪妮 劉劍輝 謝劍 劉文艷 張景云 宋光熠 鄭洪新

1.遼寧省基礎醫(yī)學研究所，遼寧 沈陽 110101 2.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是女性絕經(jīng)后雌激素水平下降導致的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松，嚴重影響絕經(jīng)后女性的生活質(zhì)量。近年研究顯示，主要由脂肪細胞合成、分泌，參與調(diào)節(jié)糖、脂及能量代謝的肽類激素——瘦素(Leptin，LP)亦表達于骨組織，與骨代謝密切相關[1]，DNA甲基化可調(diào)控骨代謝相關基因的表達，影響骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展[2-3]。本研究基于骨組織Leptin啟動子甲基化水平，探索PMOP發(fā)病以及“腎主骨”理論指導之補腎健骨中藥復方療效的分子機制，為中醫(yī)藥防治PMOP提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級Wistar大鼠(許可證號：SCXK[遼]2015-0001，遼寧長生生物技術股份有限公司)61只，3月齡，雌性未交配，體重(240±20) g。大鼠飼養(yǎng)于室溫20 ℃～25 ℃、濕度35%～65%的基礎所藥理動物室，以遼寧長生生物技術股份有限公司提供的大小鼠維持飼料飼喂。

1.2 分組與造模

隨機分出12只大鼠為正常組，余者腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉(35 mg/kg)后，經(jīng)腹部切口完整切除雙側(cè)卵巢。隨機將術者分為模型組、補腎健骨中藥復方組和仙靈骨葆陽性對照組，分別為12只、18只、19只。仙靈骨葆陽性對照組灌胃期間死亡1只。

1.3 藥物

補腎健骨中藥復方(由遼寧宏宇生物科技有限公司提供的鹿茸凍干粉、四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司提供的淫羊藿顆粒和產(chǎn)于長山島大連灣、制成平均粒徑780 nm的牡蠣殼微粉組成)；仙靈骨葆膠囊(由國藥集團同濟堂[貴州]制藥有限公司生產(chǎn)，批號180417，國藥準字Z20025337，成分：淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補骨脂、地黃)。

1.4 劑量與給藥方法

補腎健骨中藥復方組和仙靈骨葆陽性對照組給藥劑量按成人6.3倍計算，分別給補腎健骨中藥復方[鹿茸0.315 g/(kg·d)、淫羊藿0.15 g/(kg·d)、牡蠣1.05 g/(kg·d)]和仙靈骨葆膠囊粉0.315 g/(kg·d)，給藥體積：1 mL/100 g。正常組和模型組給等體積生理鹽水。術后6 d開始灌胃，1次/d(灌胃6 d，停灌1 d)，給藥14周。

1.5 取材

末次灌胃給藥后，禁食24 h，取第1～6腰椎，生理鹽水沖洗，醫(yī)用紗布包好，再以錫紙包于其外，保存在-80 ℃冰箱內(nèi)，待檢測骨密度；取股骨頭，10%福爾馬林溶液固定，待做石蠟切片HE染色；取股骨頭，裝入液氮凍存管，先以液氮速凍，再保存在-80 ℃冰箱內(nèi)，待檢測甲基化。

1.6 指標檢測

1.6.1骨密度(bone mineral density，BMD)：用X射線骨密度測定儀(STRATOS DR，Diagnostic Medical System SA，法國)檢測第1～6腰椎骨密度。

1.6.2骨組織顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)：10%硝酸脫鈣制作股骨頭脫鈣石蠟切片，HE染色，OLYMPUS BX51顯微鏡(日本)觀察骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照(400倍)。

1.6.3Leptin啟動子甲基化：質(zhì)譜法檢測：由北京博奧晶典生物技術有限公司完成。檢測片段：Leptin基因啟動子-493 bp～-19 bp，長度475 bp，CpG位點總數(shù)27個，能檢測到26個CpG位點。①引物設計： Leptin修飾后的上游引物：aggaagagagGGGTATTAAAGGATAGTTTTTGTTTTG，修飾后的下游引物：cagtaatacgactcactatagggagaa ggctACTCCATACCTACCTACCCCTCTTA。②使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，51304)提取骨組織DNA。③使用EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO，D5005)、PCR儀(96孔，BIORAD)對DNA樣品進行重亞硫酸鹽處理。④使用PCR Accessory Set(SEQUENOM，11327)和步驟①設計、合成的引物、S1000TM Thermal Cycler(384孔，BIORAD)擴增重亞硫酸鹽處理后的樣品。⑤使用MassCLEAVE Kit(SEQUENOM，10129.1)、S1000TM Thermal Cycler(384孔，BIORAD)對步驟④的PCR產(chǎn)物進行堿性磷酸酶處理(SAP)。⑥使用MassCLEAVE Kit(SEQUENOM，10129.1)、S1000TM Thermal Cycler(384孔，BIORAD)將SAP處理后的PCR產(chǎn)物進行體外轉(zhuǎn)錄和RNase酶切。⑦使用Spectro CHIP?Arrays and Clean Resin Kit(SEQUENOM，10117)、MassARRAY Nanodispenser(RS1000，SEQUENOM)將酶切產(chǎn)物純化、點樣、質(zhì)譜分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠離體第1～6腰椎骨密度

模型組與正常組相比，骨密度顯著降低(P<0.01)；補腎健骨中藥復方組、仙靈骨葆陽性對照組與模型組相比，骨密度顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠離體第1～6腰椎骨密度

2.2 各組大鼠股骨頭顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)

與正常組比較，模型組骨皮質(zhì)骨板變薄，骨松質(zhì)骨小梁明顯變細，有些部位破壞、斷裂，骨髓腔明顯擴大；與模型組比較，補腎健骨中藥復方組、仙靈骨葆陽性對照組上述病理改變均明顯改善。見圖1。

圖1 各組大鼠股骨頭石蠟切片HE染色顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)(400倍)Fig.1 Micro-morphology structure of HE stained paraffin section of the femoral head of rats in each group (400 times)

2.3 各組大鼠骨組織Leptin啟動子-493 bp～-19 bp甲基化

Leptin基因啟動子-493 bp～-19 bp檢測片段含有27個CpG位點，位點6未檢測到。圖2、表2顯示：與正常組比較，模型組CpG19、CpG22.23甲基化水平顯著升高(P<0.05)，其余位點甲基化差異不顯著。與模型組比較，補腎健骨中藥復方組(P<0.01)、仙靈骨葆陽性對照組(P<0.05)CpG19甲基化水平顯著降低，其余位點甲基化差異均不顯著。

3 討論

中醫(yī)理論認為腎為先天之本，藏精生髓主骨。腎精充盛、生髓有源、骨得濡養(yǎng)而強勁有力；腎虛精虧、生髓乏源、骨失濡養(yǎng)而痿弱無力，發(fā)為骨質(zhì)疏松。女子七七天癸竭，腎虛精虧，髓減骨枯，而引發(fā)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。故PMOP的根本病機是腎虛，臨床防治該病應補腎以健骨。

近年對骨質(zhì)疏松的研究偏重表觀遺傳，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA、染色質(zhì)重塑等[4-5]，其中DNA甲基化的研究頗受青睞。DNA甲基化是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化甲基轉(zhuǎn)移至DNA分子CpG的胞嘧啶上，甲基化基團阻止轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控序列，抑制基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控骨代謝相關基因的表達，影響骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展[2-3]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)家族中誘導成骨分化效應最強的BMP9啟動子甲基化下調(diào)其表達[6]。成骨重要基因Runx2、骨鈣素表達升高與相應啟動子甲基化降低密切相關[7]。抑制DNA甲基化會使成骨特異基因Osterix表達[8]。激活后可促進成骨細胞分化、增殖的PI3K/AKT信號通路的PIK3AP1啟動子高甲基化下調(diào)其表達[9]。左歸丸含藥血清下調(diào)Runx2、Osterix甲基化，促進骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化[10]。課題組同期研究表明，去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織Dlx5、Runx2、Osterix啟動子甲基化水平明顯升高，補腎中藥復方(鹿茸、淫羊藿、牡蠣，功效為補腎填精、益髓壯骨)通過降低骨組織Dlx5、Runx2、Osterix啟動子甲基化，有效防治PMOP[11-12]。

瘦素由肥胖基因編碼、主要由脂肪細胞合成，是蛋白質(zhì)類激素，分泌入血運送至靶器官，通過結(jié)合瘦素受體發(fā)揮生物學效應，參與調(diào)節(jié)糖、脂及能量代謝[13]。近年研究顯示，瘦素亦表達于骨組織，與骨代謝密切相關[1]，可能為骨質(zhì)疏松的防治提供新的靶點。研究顯示，瘦素可增加BMSCs表達堿性磷酸酶、骨鈣素、骨橋蛋白、核心結(jié)合因子α1，促進其成骨分化[14-16]。瘦素可上調(diào)Ⅰ型膠原蛋白表達，促進骨形成[17]。雌性瘦素基因缺乏鼠，皮下注射瘦素可顯著促進其腰椎及股骨干骺端骨形成[18]。溫陽通絡方可明顯升高去卵巢聯(lián)合氫化可的松造模的腎陽虛證大鼠血清瘦素水平而有效增加其骨密度[19]。補腎健脾方可上調(diào)大鼠血清和骨組織中瘦素、瘦素受體的表達，改善骨代謝，防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥[20]。課題組前期研究表明[21-22]，去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠下丘腦Leptin蛋白水平顯著升高、骨組織Leptin蛋白表達顯著降低；補腎中藥復方(鹿茸、淫羊藿、牡蠣，功效為補腎填精、益髓壯骨)可降低下丘腦Leptin蛋白水平、上調(diào)骨組織Leptin蛋白表達，有效防治PMOP。

圖2 骨組織Leptin基因啟動子-493 bp～-19 bp各CpG位點甲基化程度圖譜Fig.2 Methylation degree map of leptin gene promoter -493 bp - -19 bp CpG sites in bone

研究顯示，甲基化負調(diào)控瘦素基因表達[23]。那么，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病以及藥物的作用靶點是否與瘦素基因甲基化調(diào)控機制有關呢？本實驗摘除雌性大鼠雙側(cè)卵巢建立經(jīng)典的PMOP模型[24]，以骨組織Leptin基因啟動子-493 bp～-19 bp甲基化水平為效應指標，探究PMOP發(fā)病和中醫(yī)“腎主骨”理論指導下的補腎健骨中藥復方(以補腎生精、強筋健骨之鹿茸為君藥；以溫補腎陽、強筋健骨之淫羊藿為臣藥；佐以補腎壯骨、滋陰潛陽之牡蠣，全方共奏補腎填精、生髓健骨之功)防治PMOP的分子機制，以仙靈骨葆膠囊為陽性對照藥(功效為滋補肝腎、接骨續(xù)筋、強身健骨)。結(jié)果表明，模型組與正常組相比，第1～6腰椎骨密度顯著降低；股骨頭骨皮質(zhì)骨板變薄，骨松質(zhì)骨小梁明顯變細，有些部位破壞、斷裂，骨髓腔明顯擴大，說明PMOP模型復制成功。補腎健骨中藥復方組、仙靈骨葆陽性對照組與模型組相比，第1～6腰椎骨密度均顯著升高；股骨頭顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)病理改變均明顯改善，說明本研究補腎健骨中藥復方可有效防治PMOP。模型組與正常組相比，骨組織Leptin啟動子-493 bp～-19 bp CpG19、CpG22.23甲基化水平顯著升高，說明去卵巢造成骨組織Leptin啟動子高甲基化，從而抑制其轉(zhuǎn)錄，下調(diào)其表達，進而下調(diào)核心結(jié)合因子α1、堿性磷酸酶、骨鈣素、骨橋蛋白、Ⅰ型膠原表達，抑制成骨細胞分化和骨形成，導致骨質(zhì)疏松。補腎健骨中藥復方組、仙靈骨葆陽性對照組與模型組相比，骨組織Leptin啟動子-493 bp～-19 bp CpG19甲基化水平顯著降低，說明補腎健骨中藥復方和仙靈骨葆均可降低去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織Leptin啟動子甲基化，從而促進其轉(zhuǎn)錄，上調(diào)其表達，進而上調(diào)核心結(jié)合因子α1、堿性磷酸酶、骨鈣素、骨橋蛋白、Ⅰ型膠原表達，促進成骨細胞分化和骨形成，有效防治PMOP。

表2 各組大鼠骨組織Leptin基因啟動子-493 bp～-19 bp甲基化水平Table 2 Methylation level of leptin gene promoter -493 bp - -19 bp in bone of rats in each group

本研究表明，骨組織Leptin啟動子甲基化水平升高是PMOP發(fā)病的分子機制之一；補腎健骨中藥復方功能補腎填精、生髓健骨，通過降低骨組織Leptin啟動子甲基化水平的分子機制，有效防治PMOP。本研究為中醫(yī)“腎主骨”理論提供了科學的實驗依據(jù)，并為PMOP的防治提供了新的有效靶點。