王榮 張林

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110847

隨著載人航天事業(yè)發(fā)展，航天員在空間飛行期間發(fā)生的持續(xù)性骨質(zhì)減少、鈣磷再分布和代謝負(fù)平衡、骨骼生物力學(xué)性能降低等綜合表現(xiàn)，嚴(yán)重影響航天員在軌工作和回到地面后的身體健康水平[1]。采用尾部懸吊模擬失重造成的廢用性骨丟失是現(xiàn)代比較常用的研究方法[2]?；谥嗅t(yī)“腎主骨”“脾腎相關(guān)”理論，探究健脾方與補(bǔ)腎方防治模擬失重骨丟失的相互作用及其促進(jìn)骨形成的經(jīng)典Wnt信號(hào)通路作用機(jī)制，為尋求有效防治廢用性骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)治法和方劑提供研究思路和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物：健康Wistar雄性大鼠50只，SPF級(jí)，體重(200±20) g[購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001]，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由進(jìn)食水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.1.2方藥制備：健脾方由生曬參、生黃芪等組成，補(bǔ)腎方由鹿茸、淫羊藿等組成，補(bǔ)腎健脾方為補(bǔ)腎方與健脾方的合方，全部藥材購(gòu)自北京同仁堂遼寧有限責(zé)任公司。方中鹿茸打碎，過100目篩兌入藥液，3個(gè)方中其余藥物均采用常規(guī)水煎煮法提取，將所得全部藥液混合依次濃縮成0.45 g/mL、0.34 g/mL、0.79 g/mL，每個(gè)方均得到560 mL藥液備用。

1.1.3主要試劑：β-actin抗體(CST，批號(hào)：4970 s)；GAPDH抗體(ABclonal，批號(hào)：AS003)；ALP抗體(proteintech，批號(hào)：11187-1-Ap)；SPARC抗體(proteintech，批號(hào)：15274-1-Ap)；ATF4抗體(Absci，批號(hào)：#AB32007)；SFRP2抗體(Proteintech，批號(hào)：66328-1-lg)；Kremen2抗體(ABclonal，批號(hào)：A16202)；DKK-1抗體(R&D，批號(hào)：AF4010)；抗體(Absci，批號(hào)：#AB21212)；二抗羊抗鼠(ABclonal公司，批號(hào)：AS003)；二抗驢抗羊(Abbkine，批號(hào)：A21060)；二抗羊抗兔(CST，批號(hào)：7074p2)。

1.1.4主要儀器：Multiskan Fc酶標(biāo)儀(賽默飛上海儀器有限公司)、Tanon5200全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)、X射線骨密度測(cè)定儀(法國(guó)Diagnostic Medical System SA)、CTM2050S萬(wàn)能拉力試驗(yàn)機(jī)(上海能共實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1分組及處理：所有大鼠依據(jù)體重分層后按每組10只隨機(jī)分組，分成空白對(duì)照組、尾吊組、健脾組、補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎健脾組。除空白對(duì)照組外，全部大鼠采用尾部懸吊法造模，前肢著地后肢懸空，身體長(zhǎng)軸與地面呈30°角，同時(shí)對(duì)中藥干預(yù)各組大鼠予以相應(yīng)健脾方、補(bǔ)腎方、補(bǔ)腎健脾方灌胃，空白對(duì)照組與尾吊組用相同體積蒸餾水灌胃，各組大鼠每日灌胃一次，每次2 mL。實(shí)驗(yàn)第28天稱重后處死大鼠并在無菌環(huán)境下取大鼠的雙側(cè)股骨和脛骨并稱骨重，于-80 ℃保存。

1.2.2計(jì)算股骨和脛骨骨重與體重比值：結(jié)果以大鼠骨重與體質(zhì)量的比值(mg/g)表示。

1.2.3股骨和脛骨骨密度的測(cè)定：將各組骨樣本置于X射線骨密度測(cè)定儀內(nèi)，測(cè)定大鼠離體骨骨密度，以單位面積的骨礦物質(zhì)含量(g/cm2)表示骨密度值。

1.2.4股骨和脛骨生物力學(xué)性能測(cè)定：測(cè)量試樣中點(diǎn)(受壓點(diǎn))的直徑，測(cè)試時(shí)將樣本放置在萬(wàn)能拉力試驗(yàn)機(jī)上，兩個(gè)橫桿之間距離為20 mm，以3 mm/min的速率勻速加載至標(biāo)本斷裂，由力學(xué)測(cè)試機(jī)自帶軟件記錄載荷-變形曲線并分析數(shù)據(jù)。觀察各標(biāo)本股骨和脛骨最大應(yīng)力、抗彎強(qiáng)度和斷裂力等骨生物力學(xué)指標(biāo)的變化情況。

1.2.5Western blot法檢測(cè)脛骨和股骨中ALP、SPARC、ATF4、β-catenin、DKK1、Kremen2、SFRP2蛋白表達(dá)：每組隨機(jī)抽取一只大鼠脛骨，液氮研磨大鼠脛骨至粉末狀，冰上裂解，蛋白變性后以每泳道60 μg蛋白上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育對(duì)應(yīng)一抗4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次10 min, 孵育對(duì)應(yīng)二抗，洗膜，ECL法曝光，用 AlphaView SA軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin和GAPDH作內(nèi)參，計(jì)算各組骨蛋白的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠脛骨和股骨與體重比值、骨密度的變化情況

與空白對(duì)照組比，尾吊組大鼠脛骨和股骨與體重比值、骨密度顯著降低(P<0.01)；與尾吊組比，健脾組、補(bǔ)腎組大鼠脛骨和股骨與體重比值、骨密度升高(P<0.05)，補(bǔ)腎健脾組大鼠的脛骨和股骨與體重比值、骨密度顯著升高(P<0.01)；與補(bǔ)腎健脾組比，補(bǔ)腎組和健脾組大鼠的脛骨和股骨與體重比值、骨密度降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠脛骨和股骨與體重比值、骨密度比較Table 1 Comparison of ratio of tibia and femur to body weight and bone mineral density between rats in each group n=10)

2.2 各組大鼠股骨和脛骨力學(xué)性能的變化情況

與空白對(duì)照組比，尾吊組大鼠股骨和脛骨最大應(yīng)力、抗彎強(qiáng)度、斷裂力降低(P<0.05)；與尾吊組比，健脾組大鼠股骨和脛骨最大應(yīng)力、抗彎強(qiáng)度升高(P<0.05)，脛骨斷裂力升高(P<0.05)，補(bǔ)腎組股骨最大應(yīng)力、抗彎強(qiáng)度、斷裂力升高(P<0.05)，脛骨抗彎強(qiáng)度升高(P<0.05)，補(bǔ)腎健脾組大鼠股骨和脛骨最大應(yīng)力、抗彎強(qiáng)度、斷裂力升高(P<0.05)；與補(bǔ)腎健脾組比，健脾組和補(bǔ)腎組大鼠股骨最大應(yīng)力、抗彎強(qiáng)度、斷裂力降低(P<0.05)，補(bǔ)腎組大鼠脛骨最大應(yīng)力、斷裂力降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠股骨和脛骨力學(xué)性能變化情況Table 2 Changes of mechanical properties of the femur and tibia in each group n=8)

2.3 各組大鼠脛骨骨形成相關(guān)蛋白的變化情況

與空白對(duì)照組比，尾吊組大鼠脛骨中ALP、SPARC、ATF4蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)；與尾吊組比，健脾組和補(bǔ)腎組大鼠脛骨中ALP、SPARC、ATF4蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)，補(bǔ)腎健脾組大鼠脛骨中ALP、SPARC、ATF4蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；與補(bǔ)腎健脾組比，健脾組和補(bǔ)腎組大鼠脛骨中ALP、SPARC、ATF4蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠脛骨中成骨相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.1 Expression of osteogenic related protein in the tibia of rats in each group n=3)注：A：空白對(duì)照組；B：尾吊組；C：健脾組；D：補(bǔ)腎組；D：補(bǔ)腎健脾組。與空白對(duì)照組比，**P<0.01；與尾吊組比，#P<0.05，##P<0.01；與補(bǔ)腎健脾組比，▲P<0.05。

2.4 各組大鼠脛骨經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的變化情況

與空白對(duì)照組比，尾吊組大鼠脛骨β-catenin、 SFRP2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，DKK1、Kremen2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；與尾吊組比，健脾組和補(bǔ)腎健脾組大鼠脛骨β-catenin蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，補(bǔ)腎組和補(bǔ)腎健脾組大鼠脛骨SFRP2蛋白表達(dá)量顯著升高、DKK1蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，健脾組、補(bǔ)腎組和補(bǔ)腎健脾組大鼠脛骨Kremen2蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)；與補(bǔ)腎健脾組比，補(bǔ)腎組大鼠脛骨β-catenin蛋白表達(dá)量降低、Kremen2蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)，健脾組大鼠脛骨SFRP2蛋白表達(dá)量降低、DKK1蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠脛骨中經(jīng)典Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.2 Expression of Wnt pathway related proteins in the tibia of rats in each group n=3)注：A：空白對(duì)照組；B：尾吊組；C：健脾組；D：補(bǔ)腎組；D：補(bǔ)腎健脾組。與空白對(duì)照組比，**P<0.01；與尾吊組比，#P<0.05，##P<0.01；與補(bǔ)腎健脾組比，▲P<0.05。

3 討論

祖國(guó)醫(yī)學(xué)將廢用性骨質(zhì)疏松歸于“骨痿”之列，認(rèn)為由于廢用日久“久臥傷氣”和飲食不調(diào)，造成脾氣虧虛，脾虛及腎，脾虛后天水谷精微不能充養(yǎng)腎精，骨枯髓減發(fā)為骨痿[3]。同時(shí)，體液分布與正常站立時(shí)不同[4]，下肢氣血供應(yīng)不足，出現(xiàn)氣隨陽(yáng)亢，腎氣封藏失職，“髓不生骨”，并且腎不溫煦后天脾土，則脾胃運(yùn)化無力，又會(huì)加重骨痿，故脾腎虧虛是骨痿發(fā)病的主要病機(jī)?！捌⒛I相關(guān)”理論溯源于《素問·五臟生成篇》：“腎之合骨也，其榮發(fā)也，其主脾也”，揭示了腎與脾在人體骨骼強(qiáng)健等生命活動(dòng)的相互協(xié)作作用。而李中梓高度概括出脾腎并重的“腎為先天之本，脾為后天之本”觀點(diǎn)。

經(jīng)典Wnt信號(hào)通路又稱Wnt/β-catenin信號(hào)通路，在成骨細(xì)胞增殖分化過程中發(fā)揮重要地位，其主要環(huán)節(jié)為核心因子β-catenin量的積累，DKK1是通路的抑制劑，通過直接結(jié)合LRP5/6受體或與跨膜蛋白Kremen1/2形成三元復(fù)合物，阻斷向胞內(nèi)傳遞Wnt信號(hào)，從而抑制骨形成降低骨量[5]。SPARC蛋白抑制脂肪形成并促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路傳導(dǎo)[6]。ATF4基因?qū)Υ龠M(jìn)成骨細(xì)胞分化和維持骨韌性很重要，其缺失細(xì)胞中β-catenin蛋白的水平也降低[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)尾部懸吊28 d后，承重骨骨密度、生物力學(xué)性能下降，證明骨質(zhì)丟失造模成功。本研究還觀察到脛骨ALP、SPARC、ATF4、β-catenin、SFRP2蛋白表達(dá)降低，DKK-1、Kremen2蛋白表達(dá)升高，提示尾吊造成大鼠骨丟失，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路受抑制。Bullock等[8]的研究與本研究的結(jié)果相似，在尾吊和肉毒素造成的廢用性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型中，經(jīng)典Wnt途徑中細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)節(jié)點(diǎn)β-catenin發(fā)揮重要作用。本研究采用健脾方、補(bǔ)腎方、補(bǔ)腎健脾方干預(yù)尾部懸吊大鼠28 d后，各給藥組大鼠承重骨骨密度、生物力學(xué)性能、脛骨ALP蛋白表達(dá)水平都有不同程度升高，說明3種治法有促進(jìn)尾吊模型大鼠骨形成的作用，由于補(bǔ)腎健脾方作用強(qiáng)于健脾方和補(bǔ)腎方，推測(cè)健脾方與補(bǔ)腎方可能存在協(xié)同作用。結(jié)果還顯示，健脾組、補(bǔ)腎組和補(bǔ)腎健脾組大鼠股骨DKK-1和Kremen2蛋白表達(dá)減少，同時(shí)SPARC、ATF4、β-catenin、SFRP2蛋白表達(dá)增加，說明三首方劑均可激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)骨形成以修復(fù)骨丟失。SFRP2蛋白對(duì)骨代謝呈現(xiàn)出不同的作用。有研究發(fā)現(xiàn)SFRP2基因促進(jìn)BMSCs存活以對(duì)抗氧化應(yīng)激[9]，這與本研究結(jié)果趨勢(shì)一致。然而，Jin等[10]研究發(fā)現(xiàn)SFRP2在體內(nèi)外均通過增強(qiáng)β-catenin磷酸化并降低核內(nèi)表達(dá)以抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，但是SFRP2不影響DKK1的表達(dá)，因此SFRP2在尾部懸吊骨丟失模型中的作用規(guī)律尚需進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)β-catenin、Kremen2蛋白的表達(dá)在健脾組和補(bǔ)腎健脾組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，DKK1、SFRP2蛋白的表達(dá)在補(bǔ)腎組和補(bǔ)腎健脾組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但都以補(bǔ)腎健脾組為最優(yōu)，提示補(bǔ)腎方與健脾方對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路上蛋白的調(diào)控靶點(diǎn)略有差異，具有相互促進(jìn)作用，體現(xiàn)了特定藥效條件下中藥復(fù)方的多靶點(diǎn)作用特點(diǎn)。