溫 晶 李 珍 趙 偉 李富容 侯建玲 李中偉 鄭榮濤 田洪青

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院，山東省皮膚病性病防治研究所)，山東濟(jì)南，250022

梅毒血清固定亦稱(chēng)血清抵抗，是比較棘手的臨床難題，目前還沒(méi)有明確定義。中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病專(zhuān)業(yè)委員會(huì)認(rèn)為，梅毒患者經(jīng)規(guī)范的抗梅毒治療和充分隨訪(fǎng)(一期梅毒隨訪(fǎng)1年、二期梅毒隨訪(fǎng)2年、三期梅毒隨訪(fǎng)3年)，非梅毒螺旋體血清學(xué)試驗(yàn)維持在一定滴度(一般在≤1∶8，部分>1∶8)超過(guò) 3個(gè)月，排除再感染、神經(jīng)梅毒、心血管梅毒和生物學(xué)假陽(yáng)性等，即為梅毒血清固定[1]。鄭和國(guó)等[2]報(bào)道一期梅毒血清固定發(fā)生率為4.35%，二期梅毒為11.88%。與梅毒的類(lèi)型和病期、血清初始滴度、是否經(jīng)過(guò)規(guī)范治療、是否為復(fù)發(fā)或再感染、體內(nèi)是否存在潛在病灶、機(jī)體免疫情況等均有關(guān)系。血清固定的發(fā)生機(jī)制目前尚不十分清楚。有研究表明，梅毒血清固定患者體內(nèi)存在Th1/Th2型以及Treg/Th17型細(xì)胞因子失衡，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制，進(jìn)而降低機(jī)體免疫對(duì)病原體的清除能力，造成梅毒病程的遷延。本研究選取了Th1型代表細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、和IL-12，Th2型代表細(xì)胞因子IL-4、IL-10和IL-6；Th17型代表細(xì)胞因子IL-17和IL-22；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)型代表細(xì)胞因子TGF-β為對(duì)象，研究分析其在梅毒血清固定組、新發(fā)梅毒組、梅毒治療后轉(zhuǎn)陰組和對(duì)照組外周血中的濃度，探討梅毒血清固定的發(fā)生與機(jī)體免疫功能異常的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 研究對(duì)象為2012年6月至2016年10月就診于我院性病門(mén)診的120例梅毒患者，分為三組：梅毒血清固定組、新發(fā)梅毒組、梅毒治療后轉(zhuǎn)陰組，另根據(jù)配對(duì)原則選取30名同時(shí)間段內(nèi)健康體檢者作為正常對(duì)照組。梅毒血清固定組入選標(biāo)準(zhǔn)為:已接受過(guò)規(guī)范的驅(qū)梅治療，無(wú)臨床癥狀或治療后臨床癥狀消失，并經(jīng)腦脊液常規(guī)、生化及TRUST等檢測(cè)排除神經(jīng)梅毒，TRUST仍持續(xù)陽(yáng)性，持續(xù)時(shí)間定為2年以上。新發(fā)梅毒組入選標(biāo)準(zhǔn)：綜合流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查(TPPA/TRUST/PCR等)結(jié)果，梅毒確診病例均符合梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn)。梅毒治療后轉(zhuǎn)陰組入選標(biāo)準(zhǔn):患者經(jīng)梅毒正規(guī)治療后TRUST試驗(yàn)轉(zhuǎn)陰。剔除標(biāo)準(zhǔn)：①HIV抗體檢測(cè)陽(yáng)性；②患有自身免疫性疾病或其他感染性疾病者；③妊娠、哺乳期婦女；④追蹤期間有不潔性生活史者等。組間臨床資料經(jīng)對(duì)比并未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。本研究符合醫(yī)院倫理委員會(huì)要求。所有人員均表示自愿配合本研究。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑 IFN-γ、IL-2、IL-12(P70)、IL-4、IL-10、IL-6、IL-17、IL-22和TGF-β ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)、微孔振蕩器、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)、TPPA試劑盒(富士株式會(huì)社)、TRUST試劑盒(上海榮盛)等。

1.2.2 標(biāo)本采集 收集梅毒血清固定患者、梅毒治愈患者、梅毒新發(fā)患者、健康體檢者外周血標(biāo)本分離血清-20℃冰箱內(nèi)冷存。

1.2.3 對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行TPPA、TRUST、HIV、肝腎功能等檢測(cè)，操作均嚴(yán)格按照操作規(guī)則進(jìn)行。

1.2.4 細(xì)胞因子水平的檢測(cè) (1)加樣：取出預(yù)先包被封閉好的96孔板，分別加入100 μL稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋好的樣品，37℃孵育 90 min。(2)吸板：吸干酶標(biāo)板內(nèi)反應(yīng)液，在對(duì)著吸水紙拍幾下，不洗。(3)加生物素標(biāo)記抗體：加入100 μL按1∶100稀釋好的生物素標(biāo)記的抗體，37℃孵育60 min。(4)洗板：1X洗滌緩沖液洗滌3次，每次浸泡1 min。(5)加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素(ABC)：加入100 μL按1∶100稀釋好的ABC，37℃孵育30 min。(6)洗板：1X洗滌緩沖液洗滌5次，每次浸泡90 s。(7)加入底物(TMB)：每孔90 μL TMB，37℃孵育避光孵育20 min。(8)加終止液：每孔100 μL終止液，輕柔混勻。(9)讀板：根據(jù)酶標(biāo)儀器操作方法，上機(jī)檢測(cè)OD值(450 nm 處)，通過(guò)軟件(ELISACalc)計(jì)算獲得所測(cè)物質(zhì)的濃度。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 梅毒血清固定組：30例，其中男12例，女18例；年齡21～48(32.6±8.6)歲；一期梅毒3例，二期梅毒7例，隱性梅毒20例；初始滴度分別為RPR≤1∶2(11例)、RPR 1∶4～1∶8(3例)、RPR≥1∶16(16例)。新發(fā)梅毒組：30例，其中男14例，女16例；年齡19～50(36.8±10.3)歲；一期梅毒4例，二期梅毒11例，隱性梅毒15例。轉(zhuǎn)陰組：30例，其中男13例，女17例；年齡21～51(32.3±8.7)歲。對(duì)照組：30例，血清TRUST，TPPA及HIV均陰性的健康查體者,其年齡、性別等構(gòu)成比相匹配。

2.2 Th1型和Th2型細(xì)胞因子表達(dá)情況 梅毒血清固定組與新發(fā)梅毒組、轉(zhuǎn)陰組以及對(duì)照組相比，Th1型細(xì)胞因子IFN-γ(P=0.005、0.04、0.004)，IL-2(P=0.049、0.000、0.014)和IL-12(P=0.021、0.046、0.030)水平均明顯較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但Th2型細(xì)胞因子IL-4(P=0.004、0.012、0.007)和IL-10(P=0.000、0.001、0.000)水平均明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而對(duì)于IL-6，僅表現(xiàn)出血清固定組IL-6僅比對(duì)照組顯著較高(P=0.025)(表1)。

表1 Th1,Th2,Treg和Th17相關(guān)細(xì)胞因子在各組人群外周血中的濃度

2.3 Tregs和Th17型細(xì)胞因子表達(dá)情況 結(jié)果顯示，梅毒血清固定組的TGF-β與新發(fā)梅毒組、轉(zhuǎn)陰組以及對(duì)照組相比均明顯較高(P=0.005、0.013、0.032)，而血清固定組IL-17僅顯著低于新發(fā)梅毒組、轉(zhuǎn)陰組(P=0.01、0.007)，IL-22顯著低于新發(fā)梅毒組(P=0.023)(表1)。

3 討論

2019年全國(guó)梅毒報(bào)告535819例，胎傳梅毒1934例。1995-2016年，中國(guó)每年新發(fā)梅毒確診數(shù)量從11336例增加至438199例，梅毒總發(fā)病數(shù)量由每1.0/105增加到32.2/105[3]。伴隨中國(guó)梅毒的發(fā)病率迅速增長(zhǎng)的同時(shí)，血清固定的發(fā)病率也明顯上升。李軍等[4]報(bào)道一期梅毒血清抵抗發(fā)生率為8.7%，二期梅毒為20.3%，潛伏梅毒患者為42.2%。Sea等[5]發(fā)現(xiàn)約有15%～41%的梅毒患者會(huì)發(fā)生血清固定。梅毒血清固定發(fā)生與諸多因素有關(guān)，如梅毒的分期、血清初始滴度和是否進(jìn)行規(guī)范治療等。一旦進(jìn)入血清固定，重復(fù)治療對(duì)降低血清非特異性抗體滴度影響不大[6]。研究表明，如果治療初期機(jī)體能發(fā)生針對(duì)梅毒螺旋體強(qiáng)有力的促炎性免疫反應(yīng)，那么能發(fā)生血清固定的幾率會(huì)低很多[7]。

Veldhoen等[8]1986年首次依據(jù)細(xì)胞分化、功能特征和其產(chǎn)生細(xì)胞因子的不同，將特異性CD4+Th細(xì)胞細(xì)分為T(mén)h1和Th2細(xì)胞，Maggi等[9]又在1991年證實(shí)人類(lèi)存在Th1和Th2亞群。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2，IL-12和IFN-γ等細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4，IL-10和IL-6等細(xì)胞因子，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)[10]。Leader等[11]發(fā)現(xiàn)梅毒患者免疫狀況早期以Th1型細(xì)胞因子為主，Th1占優(yōu)勢(shì)。徐剛等[12]研究顯示，梅毒血清固定患者的Th1型細(xì)胞因子IL-2和IL-12明顯低于健康組和治愈組(P<0.05)；但其Th2型細(xì)胞因子IL-10又明顯高于健康組和治愈組(P<0.05)。本研究結(jié)果顯示，梅毒血清固定組與新發(fā)組、轉(zhuǎn)陰組相比，Th1型細(xì)胞因子IFN-γ，IL-2和IL-12水平均顯著較低(P<0.05)，其中IL-2可刺激NK細(xì)胞增殖，激活殺傷細(xì)胞的效應(yīng)功能；IL-12可促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其活性，同時(shí)可誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，使免疫反應(yīng)朝向Th1型方向發(fā)展，并抑制IL-4的產(chǎn)生。但Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-10水平均顯著較高(P<0.05)，其中IL-4可刺激活化B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖；IL-10可促進(jìn)體液免疫，抑制細(xì)胞免疫，使Th1/Th2細(xì)胞達(dá)到平衡[2]。另外本研究發(fā)現(xiàn)梅毒血清固定組的IL-6與新發(fā)組無(wú)顯著差異，但與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05)。IL-6細(xì)胞因子屬于IL-6家族，不但是Th2型典型細(xì)胞因子，還是一種促炎細(xì)胞因子，一種瞬間高溫細(xì)胞因子，會(huì)伴隨著青霉素的殺菌作用而產(chǎn)生，同樣在調(diào)節(jié)Treg和Th17細(xì)胞的分化也有重要作用[15]。

隨著研究的深入，來(lái)源于幼稚CD4+T細(xì)胞的另外兩種Th細(xì)胞亞群，即調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)和Th17細(xì)胞再度引起廣泛關(guān)注。Tregs細(xì)胞能夠下調(diào)機(jī)體免疫應(yīng)答的水平，減輕對(duì)機(jī)體組織的損傷以維持自身耐受，發(fā)揮免疫抑制作用；而Th17細(xì)胞恰恰相反，是最早參與抗感染免疫的效應(yīng)T細(xì)胞，可以通過(guò)IL-17細(xì)胞因子而發(fā)揮抗感染作用，并促進(jìn)炎癥反應(yīng)過(guò)程。Tregs/Th17動(dòng)態(tài)平衡同樣對(duì)維持機(jī)體適應(yīng)性免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著重要作用[13]。Zhao等[14]研究提出，如果患者體內(nèi)Tregs/Th17細(xì)胞平衡狀態(tài)異常，就會(huì)造成免疫抑制，減弱了機(jī)體對(duì)梅毒螺旋體的控制，從而導(dǎo)致血清固定。本研究顯示，梅毒血清固定組的TGF-β顯著高于轉(zhuǎn)陰組、對(duì)照組(P<0.05)，而IL-17和IL-22則相反。機(jī)體內(nèi)TGF-β的分泌水平會(huì)顯著影響Treg和Th17細(xì)胞的分化發(fā)育方向，伴隨著患者體內(nèi)TGF-β的升高，導(dǎo)致細(xì)胞分化偏向于Treg細(xì)胞，造成Th17細(xì)胞的反饋性減少。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論是Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞，還是Treg細(xì)胞/Th17細(xì)胞，在機(jī)體內(nèi)相互作用構(gòu)成復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)，而各種細(xì)胞因子之間同樣是相輔相成，亦或是此消彼長(zhǎng)，從而影響到機(jī)體對(duì)病原體的免疫應(yīng)答程度。一旦上述平衡被破壞，造成機(jī)體免疫應(yīng)答的紊亂，有可能導(dǎo)致一部分梅毒螺旋體逃過(guò)機(jī)體免疫監(jiān)視，致使梅毒感染進(jìn)入慢性階段，而在臨床上表現(xiàn)為血清固定。從而推測(cè)無(wú)論是Th1/Th2，還是Treg/Th17的失衡在梅毒患者體內(nèi)也許是普遍現(xiàn)象，只是血清固定患者的失衡現(xiàn)象更加明顯。