姜 媛 張彩云 孔慶濤 桑 紅

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院)皮膚科,江蘇南京,210006；2南京市中醫(yī)院，江蘇南京，210001；3東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院皮膚科，江蘇南京，210002

侵襲性真菌感染在近幾年的發(fā)病率不斷升高，每年感染死亡人數(shù)超過一百萬[1]。其中侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis, IA)的發(fā)病率在侵襲性真菌感染中的比例越來越高，侵襲性曲霉病患者臨床癥狀比較嚴(yán)重，致死率可高達(dá)50%～95%[2],因此，早期正確的診斷對于侵襲性曲霉病高風(fēng)險患者十分重要。

煙曲霉是導(dǎo)致侵襲性曲霉病最主要的病原體[3],在形態(tài)上與煙曲霉相似的新真菌逐漸被報道，進(jìn)而導(dǎo)致煙曲霉被誤診率也逐漸增多。目前，煙曲霉形態(tài)學(xué)研究已較為成熟,在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，煙曲霉一般會表現(xiàn)為灰綠色、粉末狀、放射性生長絲狀型菌落，在光學(xué)顯微鏡下觀察有分生孢子形成。煙曲霉的傳播主要是通過無性孢子感染宿主來實現(xiàn)；煙曲霉孢子既是它自身存在和傳播的方式，也是感染人類的根源，大量的孢子很容易擴(kuò)散到環(huán)境中，易感人群可以通過吸入孢子而感染該病菌[4]。但最新研究發(fā)現(xiàn)，存在形態(tài)學(xué)、毒力等方面均不具有上述特點的煙曲霉[5，6]；Zhang等[6]已經(jīng)報道過第一例非典型的(白色不產(chǎn)孢)煙曲霉(命名為A1j)，且經(jīng)過長時間的傳代，形態(tài)仍然未變。我們團(tuán)隊先前已經(jīng)報道兩株非典型煙曲霉在形態(tài)學(xué)和毒力方面的差異，發(fā)現(xiàn)兩株非典型煙曲霉生長速度不同，A2j的生長速度快，且耐熱性高，毒力強(qiáng)[5]。

目前，用于治療侵襲性肺曲霉病的抗真菌藥物包括以下三種：以伊曲康唑和伏立康唑為代表的唑類抗真菌藥、以兩性霉素B為代表的多烯類抗真菌藥、以卡泊芬凈為代表的棘白素類。其中伏立康唑是目前治療曲霉病的一線藥物，AMB最常用多烯類藥物[4，7，8]。另外，抗真菌藥的廣泛使用，使耐藥性曲霉菌增多，新一代抗真菌藥物的開發(fā)刻不容緩[8]。

在此背景下，我們將兩株非典型煙曲霉(A1j和A2j)臨床株與參照株Af293進(jìn)行對比，研究其對抗真菌藥物敏感性及形態(tài)學(xué)異常相關(guān)產(chǎn)孢分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基 A2j：從患者的肺組織標(biāo)本中分離純化的曲霉屬真菌，現(xiàn)保存于中國醫(yī)學(xué)真菌菌種保藏中心(CMCC，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所)。菌株采用酵母瓊脂葡萄糖(YAG)培養(yǎng)基[6]。

1.2 分子鑒定 A2j采用如下方法進(jìn)行鑒定：將菌株放在沙氏培養(yǎng)基(SDA)(10 g蛋白胨+12～15 g瓊脂+40 g葡萄糖+1L蒸餾水)上25℃恒溫培養(yǎng)7 d[9]，接著提取A2j DNA基因，采用真菌基因組DNA提取試劑盒(杭州博日科技有限公司)，然后進(jìn)行測序比對。選用真菌通用引物如下：ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)擴(kuò)增ITS區(qū)域(包括ITS-1, ITS-2,和5.8S rRNA)[6]，benA-F(5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’)和benA-R(5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’)擴(kuò)增β-tub部分基因序列[9，10]。

1.3 形態(tài)學(xué)特征 (1)培養(yǎng)條件：在 YAG培養(yǎng)基37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d、3 d、4 d、6 d，觀察A2j菌落形態(tài)；(2)小培養(yǎng)法：本研究中采用的小培養(yǎng)法參照已有文獻(xiàn)報道并稍作改動的改良小培養(yǎng)法[6]，具體操作步驟是：首先準(zhǔn)備好數(shù)個YAG平板(根據(jù)觀察菌種的數(shù)量來定)，取出一個平板，用無菌的手術(shù)刀將其中的培養(yǎng)基劃成邊長7～10 mm的小塊；然后在新YAG平板上放置5～6個劃好的小塊(各小塊之間留出適當(dāng)?shù)目臻g)；再在小塊各邊中點上用接種針(或滅菌的牙簽)接種相應(yīng)的菌株；然后將18 mm×18 mm的蓋玻片蓋上，蓋好培養(yǎng)皿蓋后放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)18 h，然后用棉蘭染色放在DIC顯微鏡下觀察各菌落形態(tài)。最好每個平板中只接種一種菌，防止培養(yǎng)時間長時出現(xiàn)相互播散的狀況。

1.4 試劑 ①裂解液:400 mM Tris-HCl(PH8.0),60 mM EDTA(PH8.0),150 mM NaCl，1% SDS；②KAC(PH 4.8,100 mL): 5M乙酸鉀60 mL,冰醋酸11.5 mL, 蒸餾水28.5 mL；③焦碳酸二乙酯(DEPC)： 500 mL去離子水中先加入500 μL DEPC，然后搖床過夜，第二天高溫高壓滅菌30 min。

1.5 抗真菌藥物敏感性試驗

1.5.1 將伏立康唑(VRC),兩性霉素B(AMB)和伊曲康唑(ITC)用二甲基亞砜(DMSO，上海生工)溶解成適當(dāng)濃度的母液備用。

1.5.2 藥物平板的配制 首先配置好適量的YAG培養(yǎng)基，接著進(jìn)行高壓滅菌冷卻至60℃左右，每次倒出9 mL在離心管中，加入并混勻適當(dāng)體積的藥物母液后立即倒入無菌平板中，制成不同濃度的各種藥物平板。然后在超凈臺中吹干冷凝備用。這些藥物平板最好能夠現(xiàn)配現(xiàn)用，以防藥物失效。

1.5.3 Af293菌懸液的配制 將Af293接種于YAG固體平板，37℃恒溫培養(yǎng)2 d。用0.002% Tween 80收集孢子，經(jīng)8層紗布過濾后用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，并稀釋成108/mL的孢子懸液,最好當(dāng)天配當(dāng)天用。

1.5.4 接種步驟 為保證菌絲塊面積的一致，對菌落采用打孔的方法[6]：首先將A1j和A2j分別接種到Y(jié)AG固體平板上，37℃恒溫培養(yǎng)2 d；將100 μL濃度為108/mL的對照菌Af293新鮮孢子液到Y(jié)AG平板上，并在37℃培養(yǎng)15 h；從而確保三株菌都為菌絲狀態(tài)。然后用5 mm的打孔器將上述菌絲分別放入濃度分別為：2, 4, 8, 16, 32 μg/mL ITC平板中; 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 μg/mL VRC平板中; 4, 8, 16, 32, 64 μg/mL AMB平板中;并在37℃恒溫培養(yǎng)1.5 d。

1.5.5 統(tǒng)計學(xué)方法 三株菌37℃恒溫培養(yǎng)1.5 d后從平板背面測量菌落直徑(D)。為了減少誤差，將各個藥物平板菌落直徑減去原始接種直徑(5 mm)后與不加藥物的菌落直徑減去原始接種直徑(5 mm)后的差值作比值，即(Dstrain+drug-5 mm)/(Dstrain-5 mm)，來比較各種藥物對三株菌的相對抑制程度。實驗將重復(fù)3次，并以中位數(shù)±四分位數(shù)間距描點作圖。

1.6 DNA，RNA提取和分析

1.6.1 RNA提取和qRT-PCR分析的樣品準(zhǔn)備 將制備好的A1j和A2j菌絲片和100 μL濃度為108/mL Af293的孢子懸液，分別接種到100 mL YAG液體培養(yǎng)基中；并置于220 rpm 轉(zhuǎn)速的37℃的溫控?fù)u床中培養(yǎng)18 h。然后用4層無菌紗布濾出菌絲球，重新在37℃恒溫培養(yǎng)6 h[6]；完成后用錫箔紙將干菌絲球，液氮速凍30 min，存放于-80℃的超低溫冰箱中，完成產(chǎn)孢誘導(dǎo)前的樣品。

1.6.2 1%瓊脂糖凝膠的制備 以1 g瓊脂：100 mL TAE (1×)的比例混合，放入微波爐中加熱至沸騰2～3次，直至膠液澄清透明。稍冷卻后滴入少量EB至液體顏色微微改變，混勻后倒入膠槽中，約20 min凝固后即可使用。短期可保存于蒸餾水中。

1.6.3 RNA提取方法(Trizol法)和 qRT-PCR的提取 用Trizol法提取總RNA，然后根據(jù)RevertAidTM First strand eDNA Synthese Kit試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA,以逆轉(zhuǎn)錄的eDNA為模板，用Taqman探針法進(jìn)行PCR產(chǎn)物的實時熒光定量分析。

2 結(jié)果

2.1 A2j的鑒定 通過對A2j的ITS區(qū)(包含ITS-1，ITS-2和5.8S rRNA基因)和部分β-微管蛋白基因(β-Tub)進(jìn)行測序來進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果顯示，在NCBI中，該分離株序列與煙曲霉ITS具有99%的相似性，與煙曲霉β-Tub序列具有100%的相似性。 在AspGD(http://www.aspgd.org/)中，分別為99.5%和99.8%。因此，其被準(zhǔn)確鑒定為煙曲霉。

2.2 形態(tài)學(xué)特征

2.2.1 不同時間的菌落形態(tài) 如圖1所示，A2j一直保持增長趨勢，且一直表現(xiàn)為白色毛毯狀菌落，生長速度基本與Af293相當(dāng)。

圖1 A2j不同培養(yǎng)時間的菌落形態(tài)

2.2.2 小培養(yǎng)和DIC顯微鏡下觀察 兩株菌株采用小培養(yǎng)的方法置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，接著在DIC顯微鏡下觀察兩者的產(chǎn)孢情況。如圖2所示，A2j可見分支分隔的菌絲，但是始終未見產(chǎn)孢，Af293可見典型的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。

圖2 A2j(2a)DIC顯微鏡下的形態(tài)與野生型Af293(2b)的對比 圖3 在不加藥時A1j和A2j生長速度與野生型Af293的對比

2.3 抗真菌藥藥敏試驗 在不加藥時A1j的生長速度比Af293慢(圖3)。對于ITC,A1j和Af293生長趨勢一致，但是在低藥濃度時A1j表現(xiàn)比Af293更敏感，當(dāng)濃度達(dá)到8 μg/mL時，兩者無統(tǒng)計學(xué)差異(圖4，P=0.076)。對于AMB,兩株菌生長趨勢同樣一致,但是在高藥濃度時A1j似乎比Af293更敏感(圖5)。對于VRC,A1j與Af293表現(xiàn)出一致趨勢，但是在濃度為0.125 μg/mL時已無統(tǒng)計學(xué)差異(圖6,P=0.083)。在不加藥物時，A2j生長速度與Af293差不多(圖3)。ITC,AMB和VRC普遍表現(xiàn)為在抑制Af293時也抑制A2j。對于ITC, 當(dāng)藥物濃度在8 μg/mL之前均表現(xiàn)為A2j受抑制程度比Af293高，藥物濃度達(dá)到16 μg/mL時，Af293受抑制程度比A2j高(圖7)。對于AMB,當(dāng)藥物濃度大于16 μg/mL時，它們表現(xiàn)出相同抑制程度，小于16 μg/mL時，A2j受抑制程度比Af293高(圖8)。但是對于VRC,兩株菌表現(xiàn)出明顯一致的差異，當(dāng)濃度達(dá)到2 μg/mL時已無統(tǒng)計學(xué)差異(圖9，P=1.000)。因此，無論是A2j與Af293，還是A1j與Af293，在藥物敏感性方面均沒有顯著差異。

圖4 A1j對ITC抗真菌藥物的敏感性與野生型Af293的對比

圖5 A1j對AMB抗真菌藥物的敏感性與野生型Af293的對比

圖6 A1j對VRC抗真菌藥物的敏感性與野生型Af293的對比

圖7 A2j對ITC抗真菌藥物的敏感性與野生型Af293的對比

圖8 A2j對AMB抗真菌藥物的敏感性與野生型Af293的對比

圖9 A2j對VRC抗真菌藥物的敏感性與野生型Af293的對比

2.4 形態(tài)異常產(chǎn)孢相關(guān)分子機(jī)制

2.4.1 產(chǎn)孢下游基因brlA和wetA qRT-PCR表達(dá)差異的結(jié)果 如圖10所示，經(jīng)固體培養(yǎng)6 h后，Af293的wetA沒有明顯變化，但brlA轉(zhuǎn)錄水平卻顯著上升。且brlA FC(6 h/0 h)值達(dá)到了21.82±0.88，而A1j和A2j中對應(yīng)的3個基因則無明顯變化。

圖10 調(diào)控產(chǎn)孢的兩個基因，brlA和wetA在產(chǎn)孢誘導(dǎo)條件下在A1j、A2j和Af293中的表達(dá)分別受誘導(dǎo)程度的qRT-PCR分析結(jié)果

2.4.2 brlA基因測序 由于brlA是調(diào)控A. fumigatus分生孢子梗形成的最關(guān)鍵基因，因此我們PCR擴(kuò)增A1j的brlA基因全長進(jìn)行測序，并在曲霉專業(yè)數(shù)據(jù)庫AspGD和NCBI上分別進(jìn)行比對，結(jié)果顯示比對率為99.9%和100%，同時進(jìn)行峰圖比對沒有發(fā)現(xiàn)突變點，說明A1j的brlA基因無突變。A2j的brlA基因全長進(jìn)行測序，并在曲霉專業(yè)數(shù)據(jù)庫AspGD和NCBI上分別進(jìn)行比對，結(jié)果顯示比對率為99.8%和99%，同時進(jìn)行峰圖比對發(fā)現(xiàn)存在TCCT缺失。

3 討論

煙曲霉是一種引起免疫缺陷群體患有侵襲性曲霉病的主要致病菌，該病致死率極高[2]。為避免與煙曲霉形態(tài)學(xué)相似的物種所導(dǎo)致的曲霉病誤診情況的發(fā)生，推薦使用分子鑒定方法。常用的兩種分子鑒定方法是：對真菌基因組DNA保守序列ITS和b-tub進(jìn)行測序比對。前者能將真菌鑒定到種的水平，后者可以鑒定到屬的水平[11]；此次試驗結(jié)合上述兩種方法，來實現(xiàn)新發(fā)現(xiàn)的煙曲霉復(fù)合體的準(zhǔn)確鑒定。

本研究中所用到的三種抗真菌藥物，AMB、ITC和VRC，作為經(jīng)典的抗真菌藥物作用機(jī)制如下：唑類藥物(伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑)的作用機(jī)制是抑制麥角固醇合成途徑中的重要酶-羊毛固醇-14a-脫甲基酶(cyp51A)的合成。而兩性霉素B(AMB)是通過影響細(xì)胞的正常代謝從而抑制其生長來發(fā)揮作用，它損傷細(xì)胞膜的通透性從而使細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)外漏、破壞[11,12]。兩株非典型煙曲霉在對抗真菌藥物敏感性方面沒有差異，這表明它們在麥角固醇合成途徑方面均沒有明顯缺陷。

近年來，有學(xué)者闡明了調(diào)節(jié)煙曲霉分生孢子形成的通路[13],該通路包括三個關(guān)鍵基因即brlA,abaA和wetA。其中brlA是啟動曲霉孢子產(chǎn)生的關(guān)鍵基因[13,14]，表達(dá)于孢子形成的早期階段。brlA突變株產(chǎn)生較細(xì)菌絲，且不能產(chǎn)生無性產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，這表明brlA在初始階段煙曲霉孢子形成過程中很重要。不僅如此，brlA也會影響孢子形成相關(guān)其他基因的表達(dá)，比如：abaA, wetA, vosA,和rodA。brlA參與其他生物功能：brlA刪除株將改變與孢子色素形成、膠霉毒素的生物合成和核糖體的途徑相關(guān)的基因；brlA刪除株會使GliM和GliT蛋白表達(dá)減少和膠霉毒素不能產(chǎn)生。另外，abaA是調(diào)節(jié)瓶梗分化和功能的關(guān)鍵基因，它的表達(dá)主要依賴brlA，而非wetA。wetA對孢子的完整性很重要，wet缺乏株導(dǎo)致孢子缺乏細(xì)胞壁及黑色素，wet刪除株也會降低菌絲的延伸能力[15]。

本文采用RT-PCR方法研究兩株白色煙曲霉產(chǎn)孢相關(guān)主要基因brlA和wetA發(fā)現(xiàn)：調(diào)控下游通路的關(guān)鍵基因brlA表現(xiàn)A1j和A2j均下降；從而解釋了為什么A1j和A2j能夠表現(xiàn)出穩(wěn)定的可傳代的白色絨毛狀且不產(chǎn)孢的形態(tài)。brlA基因的全長測序顯示A1j無突變, 但實驗結(jié)果顯示A2j存在基因突變(TCCT堿基缺失)。A2j的brlA基因TCCT堿基缺失是首次報道。對這兩株白色煙曲霉研究將提高我們對這種白色不產(chǎn)孢煙曲霉的認(rèn)識，有利于其他研究者對這種非典型煙曲霉的研究，同時brlA基因抑制劑有望成為下一代曲霉病治療新方法。

綜上所述，本次研究成果可歸納為以下幾點：(1)藥物敏感性方面，A1j和A2j的抗真菌藥物藥敏性方面無差異，這表明它們在麥角固醇合成途徑方面沒有明顯缺陷。(2)形態(tài)異常相關(guān)產(chǎn)孢基因方面 ，A1j和A2j的brlA基因均下降，brlA基因的全長測序顯示A1j無突變, A2j存在TCCT堿基缺失。這是否與兩株菌毒力差異有關(guān)，以及形態(tài)相關(guān)產(chǎn)黑相關(guān)基因是否也有差異，這都將有待進(jìn)一步研究。