呂 新，劉蘭英，陳麗華，李玥仁

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，福建 福州 350003；2. 福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003）

0 引 言

【研究意義】沙門氏菌是最主要的病原微生物之一，由其引起的食物中毒占食物中毒病例的第1或第2位[1]。僅在2005—2011年，國(guó)外發(fā)生的19起蔬菜因病原微生物污染而引起的食源性疾病案例中，有11起是由沙門氏菌污染引起的，占比高達(dá)58%[2]。沙門氏菌也是我國(guó)食源性疾病的主要病原體，我國(guó)發(fā)生的細(xì)菌性食源性中毒事件中有80%左右由沙門氏菌引起[3]。國(guó)內(nèi)已有多篇研究文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)胡蘿卜、香菜、香蔥、生菜等新鮮蔬菜中存在沙門氏菌污染風(fēng)險(xiǎn)[4?6]。蔬菜的沙門氏菌污染可能發(fā)生在從農(nóng)田到餐桌的每個(gè)環(huán)節(jié)[7?8]，近年來(lái)，隨著對(duì)蔬菜供應(yīng)鏈主要環(huán)節(jié)中沙門氏菌污染風(fēng)險(xiǎn)和來(lái)源的深入研究，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌污染風(fēng)險(xiǎn)雖然貫穿供應(yīng)鏈的每個(gè)主要環(huán)節(jié)，但仍以栽培環(huán)節(jié)，特別是蔬菜栽培土壤中沙門氏菌污染風(fēng)險(xiǎn)最大，也是沙門氏菌檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)控制的重點(diǎn)[8?11]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP）已經(jīng)運(yùn)用到多種食品中沙門氏菌的快速檢測(cè)中，因其具有快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注。Hara-Kudo等[12]采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可以檢出沙門氏菌最低含量為2.2 CFU·管?1，并在1 h以內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果；張宏偉等[13]采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)食品樣品中沙門氏菌最低檢出限為1.5 CFU·hg?1；王瑾等[14]采用實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可檢測(cè)沙門氏菌最低含量為6 CFU·管?1，人工污染雞肉的檢出限為450 CFU·g?1，全程用時(shí)約7 h；Wu等[15]利用實(shí)時(shí)熒光定量環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)生菜中沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度達(dá)到了4 CFU.g?1，而檢測(cè)過(guò)程僅需3 h左右；龐心怡等[16]采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)肉類中沙門氏菌，對(duì)人工污染的沙門氏菌肉樣檢測(cè)靈敏度達(dá)98 CFU·mL?1，而全程僅用時(shí)15 h?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對(duì)沙門氏菌檢測(cè)多采用國(guó)標(biāo)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB 4 789.4—2016）方法，但該方法需要對(duì)待檢樣品進(jìn)行預(yù)增菌、選擇性分離和生化試驗(yàn)鑒定，操作繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，僅篩選出沙門氏菌可疑菌落就需要3～4 d，后續(xù)的生化試驗(yàn)還需2～3 d[17]，滿足不了沙門氏菌快速檢測(cè)的要求。而環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）最早在2000年由日本科學(xué)家Notomi[18]發(fā)明，該技術(shù)可在恒溫條件下（60～65 ℃）1h內(nèi)完成核酸的高倍擴(kuò)增，靈敏度比PCR技術(shù)高2～7個(gè)數(shù)量級(jí)，反應(yīng)產(chǎn)物不僅可以通過(guò)瓊脂糖電泳、濁度儀和定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，也可以通過(guò)鈣黃綠素、羥基萘酚藍(lán)、SYBR Green I顯色后觀察[19,20]，目前已成功應(yīng)用于沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、副溶血弧菌、志賀氏菌等多種病原微生物的檢測(cè)[14,21?23]，但國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有關(guān)蔬菜栽培土壤中沙門氏菌LAMP檢測(cè)方法的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以沙門氏菌特有侵襲蛋白A （invA）基因序列設(shè)計(jì)可視化LAMP檢測(cè)引物，建立基于鈣黃綠素顯色的蔬菜栽培土壤中沙門氏菌可視化快速檢測(cè)方法，以期為蔬菜栽培土壤中沙門氏菌的防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 蔬菜栽培土壤 供試蔬菜栽培土壤樣品集自閩清縣東橋鎮(zhèn)綠輝蔬菜種植農(nóng)場(chǎng)，樣品按S型多點(diǎn)采集土壤表層（0～20 cm）的混合樣，采樣后立即用冰袋包裝新鮮樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，人工除去植物殘?bào)w、根系和石頭，過(guò)2 mm篩后測(cè)定土壤理化指標(biāo)。供試蔬菜栽培土壤具體理化指標(biāo)如下：土壤類型為黃紅壤，0～20 cm土層pH值5.31，有機(jī)質(zhì)含量16.61 g·kg?1，堿解氮含量126.54 mg·kg?1，速效磷含量 18.25 mg·kg?1，速效鉀含量113.79 mg·kg?1。

1.1.2 材料與試劑 胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司），DL2000 Marker、dNTP（Takara公司），Bst 2.0 DNA polymerase（美國(guó)NEB公司），瓊脂糖（西班牙Biowest），Betaine、Tween-20（上海生工），MnCl2、NaCl、Calcein（阿 拉 丁 公 司），F(xiàn)astDNA?Spin Kit for Soil試劑盒（美國(guó)MP Bio公司），無(wú)菌均質(zhì)袋（ 北京陸橋）。

1.1.3 儀器與設(shè)備 PCR儀（BIO-RADTMS1000），凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RADTMGel Doc XR+），F(xiàn)astPrepTMFP120核酸提取儀（美國(guó)MP Bio公司），easyMixTM拍擊式均質(zhì)器（法國(guó)AES Chemunex公司），電泳儀及電源（北京六一儀器廠），恒溫水浴鍋（上海一恒 ），恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒）。

1.1.4 菌株 表1為供試7種微生物菌株，分別來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）、中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）和美國(guó)典型 培養(yǎng)物保存中心（ATCC）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genbank登錄的沙門氏菌特有侵襲蛋白A （invasion protein A，invA）基因序列（Accession: M90846.1），在網(wǎng)站（http://primerexplorer.jp/e/）上使用Primer Explorer 5.0在線軟件設(shè)計(jì)3對(duì)LAMP引物用于沙門氏菌檢測(cè)，包括1對(duì)外引物（F3/B3）、1對(duì)內(nèi)引物（FIP/BIP）和1對(duì)環(huán)引物（Loop F/Loop B）。檢測(cè)引物交由上海生工合成。具體檢測(cè)引物序列見(jiàn)表2。

表 1 供試菌株Table 1 Bacteria used for testing

表 2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物Table 2 Primers of LAMP

1.2.2 沙門氏菌培養(yǎng)、計(jì)數(shù)及基因組DNA提取 將TSA平板內(nèi)活化的沙門氏菌，挑取單個(gè)菌落接種于5 mL TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min?1過(guò)夜培養(yǎng)15～18 h，以1∶100比例轉(zhuǎn)接于100 mL TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r·min?1培養(yǎng)3 h左右至細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600≈0.55）。菌液使用生理鹽水按10倍梯度依次稀釋后，分別取100 μL不同濃度稀釋液涂于TSA平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)18～24 h計(jì)數(shù)。

沙門氏菌DNA模板采用熱裂解法提取，取1 mL沙門氏菌菌液在臺(tái)式離心機(jī)上10 000 r·min?1離心5 min，棄上清液，沉淀重懸于0.5 mL生理鹽水，加入等體積2×TZ裂解液，于99.5 ℃加熱10 min，冰上冷卻2 min后，在10 000 r·min?1離心5 min，取上 清液即為沙門氏菌DNA模板，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化 分別對(duì)LAMP反應(yīng)體系中dNTPs濃度、MgSO4濃度以及Betaine濃度，反應(yīng)條件中反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，其中dNTPs終濃度分別為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mmol·L?1，MgSO4終濃度分別為2、4、6、8、10、12 mmol·L?1，Betaine終 濃 度 分 別 為0.6、0.8、1.2、1.4、1.6 mol·L?1；反 應(yīng) 溫 度 分 別 設(shè) 置58、59、60、61、62、63、64、65 ℃，反應(yīng)時(shí)間分別為30、40、50、60、70、80、90 min。選用50 μmol·L?1Calcein-500 μmol·L?1MnCl2作 為 指 示 劑[24]，陽(yáng) 性 反 應(yīng) 顯 綠色，陰性反應(yīng)顯橘黃色，每個(gè)因子設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以 確定最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

1.2.4 LAMP反應(yīng)特異性檢測(cè) 分別以鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、大腸埃希氏菌O157:H7、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌菌株為材料，以熱裂解法制備各菌株DNA，驗(yàn)證所建立LAMP檢測(cè)方法的特異性。取1 μL各菌株的DNA作為模板，采取已優(yōu)化的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行特異性分析，反應(yīng)結(jié)束后，以管內(nèi)顏色變化來(lái)判斷陰陽(yáng)性，陽(yáng)性為綠色，陰性為橘黃色；或?qū)U(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖電泳上檢測(cè)，陽(yáng)性反應(yīng)可觀察到特征性梯形帶，陰性反應(yīng)則沒(méi)有出 現(xiàn)擴(kuò)增條帶。

1.2.5 LAMP反應(yīng)靈敏度檢測(cè) 以10倍遞減將沙門氏 菌 濃 度 稀 釋 為7×108～7×102CFU·mL?17個(gè) 梯度，以熱裂解法提取沙門氏菌DNA，然后取1 μL不同含量的沙門氏菌DNA作為模板，對(duì)LAMP反應(yīng)靈敏度進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果直接肉眼觀察，陽(yáng)性反應(yīng)顯綠色，陰性反應(yīng)顯橘黃色，同時(shí)在2%瓊脂糖凝膠電泳上檢 測(cè)。

1.2.6 人工污染沙門氏菌的栽培土壤樣品檢測(cè) 取10 g經(jīng)國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)沙門氏菌陰性的蔬菜栽培土壤樣品，置于裝有90 mL蛋白胨緩沖水（BPW）的無(wú)菌均質(zhì)袋中，分別加入滅菌生理鹽水稀釋至適宜含量的沙門氏菌0.5 mL，以制備含沙門氏菌含量為0、5×101、4×102、1×103、4×103、1×104、4×104、1×105CFU·g?1的人工污染樣品，將均質(zhì)袋放置在拍擊式均質(zhì)器中拍打1 min，置37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)增菌4 h。預(yù)增菌后重新混勻土壤樣品，吸取1 mL混勻土壤樣品至FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒中的土壤裂解管中，12 000 r·min?1離心3 min，吸棄上清，然后在FastPrepTMFP120核酸提取儀上提取土壤微生物總DNA，100 μL溶解土壤微生物總DNA，取1 μL作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)擴(kuò)增模板。

1.2.7 蔬菜栽培土壤中沙門氏菌污染的檢測(cè) 利用所建立的蔬菜栽培土壤中沙門氏菌LAMP檢測(cè)方法對(duì)采自全省不同蔬菜產(chǎn)區(qū)的41份土壤樣品進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè)，同時(shí)采用國(guó)標(biāo)方法（GB 4789.4—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》）進(jìn)行檢測(cè)分 析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP檢測(cè)方法的建立

通過(guò)反應(yīng)溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，確定LAMP最適反應(yīng)溫度為65 ℃，反應(yīng)時(shí)間為1 h。優(yōu)化后蔬菜栽培土壤中沙門氏菌LAMP檢測(cè)最佳反應(yīng)體系25 μL包括：2.5 μL 10×Isothermal Amplification Buffer，1.4 mmol·L?1dNTPs，0.2 μmol·L?1F3-B3，1.6 μmol·L?1FIPBIP，0.4 μmol·L?1Loop F～Loop B，0.8 mol·L?1Betaine，6.0 mmol·L?1MgSO4，8 U Bst 2.0 DNA polymerase，50 μmol·L?1Calcein和500 μmol·L?1MnCl2，DNA模板1 μl，滅菌超純水補(bǔ)足25 μL體積。優(yōu)化的LAMP反應(yīng) 效果如圖1所示。

圖 1 LAMP體系檢測(cè)沙門氏菌Fig. 1 Detection of Salmonella using optimized LAMP assay

2.2 特異性檢測(cè)結(jié)果

分別以鼠傷寒沙門氏菌菌株和非沙門氏菌菌株的DNA為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)特異性分析，結(jié)果表明，在Calcein-MnCl2指示劑的作用下，65 ℃溫育1 h后，鼠傷寒沙門氏菌LAMP反應(yīng)產(chǎn)物顯綠色，而供試6個(gè)非沙門氏菌菌株的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物均顯橘黃色（圖2-A）。進(jìn)一步取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果除鼠傷寒沙門氏菌LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)梯形條帶外，其他6個(gè)菌株均未出現(xiàn)任何條帶（圖2-B）。結(jié)果表明，本研究所建立的可視化LAMP檢測(cè)方法對(duì)沙門氏菌具有良好的特 異性。

2.3 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

分別以7個(gè)不同含量沙門氏菌DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)驗(yàn)證LAMP體系的靈敏度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，在每管25 μL LAMP反應(yīng)體系中沙門氏菌DNA含量為7×105～7 CFU時(shí)均可以出現(xiàn)LAMP產(chǎn)物特有的梯形條帶（圖3-A），而當(dāng)沙門氏菌DNA含量為7 ×10?1CFU時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)任何條帶。可視化顯色結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致（圖3-B），說(shuō)明L AMP反應(yīng)體系可以檢測(cè)到7 CFU沙門氏菌DNA。

圖 2 LAMP方法檢測(cè)沙門氏菌的特異性Fig. 2 Specificity of LAMP assay in detecting Salmonella

圖 3 LAMP方法檢測(cè)沙門氏菌的靈敏度Fig. 3 Sensitivity of LAMP assay in detecting Salmonella

2.4 人工污染沙門氏菌的栽培土壤樣品檢測(cè)結(jié)果

人工污染沙門氏菌的栽培土壤樣品經(jīng)37 ℃預(yù)增菌4 h后，提取土壤微生物總DNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。分別設(shè)置0、5×101、4×102、1×103、4×103、1×104、4×104、1×105CFU·g?1共7組 不 同 梯 度 進(jìn) 行LAMP擴(kuò)增檢測(cè)。瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，當(dāng)LAMP反應(yīng)體系中沙門氏菌含量為4×102～1×105CFU·g?1時(shí)均可以出現(xiàn)LAMP產(chǎn)物特有的梯形條帶（圖4-A），而當(dāng)沙門氏菌含量為5×101CFU·g?1時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)任何條帶?？梢暬@色結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致（圖4-B），說(shuō)明本LAMP反應(yīng)體系檢測(cè)蔬菜栽培土壤 樣品靈敏度為4×102CFU·g?1。

2.5 蔬菜栽培土壤中沙門氏菌污染的檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用上述LAMP檢測(cè)方法和國(guó)標(biāo)檢測(cè)法，同時(shí)對(duì)全省不同蔬菜產(chǎn)區(qū)的41份土壤樣品進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。2種方法都檢測(cè)到2份沙門氏菌陽(yáng)性樣品和39份沙門氏菌陰性樣品，LAMP檢測(cè)方法與國(guó)標(biāo)方法（GB 4789.4—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》）檢測(cè)結(jié)果一致，而LAMP檢測(cè)將國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)時(shí)間由5～7 d縮短至8 h內(nèi)，大幅減輕 了檢測(cè)強(qiáng)度，提高了檢測(cè)效率。

圖 4 LAMP方法檢測(cè)人工污染沙門氏菌的栽培土壤樣品Fig. 4 LAMP assay for detecting artificially inoculated Salmonella in soil samples

表 3 2種方法對(duì)比檢測(cè)蔬菜栽培土壤沙門氏菌污染結(jié)果Table 3 Salmonella detection in soil by two different methods

3 討論與結(jié)論

快速檢測(cè)技術(shù)是監(jiān)測(cè)和防控沙門氏菌等食源性疾病最重要的環(huán)節(jié)之一，而衡量快速檢測(cè)技術(shù)性能最關(guān)鍵指標(biāo)是檢測(cè)用時(shí)與靈敏度。目前采用的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016），需要對(duì)待檢樣品進(jìn)行預(yù)增菌、選擇性分離和生化試驗(yàn)鑒定等步驟，操作繁瑣；最終拿到鑒定結(jié)果需要5～7d，耗時(shí)費(fèi)力，難以滿足沙門氏菌快速檢測(cè)的要求。PCR方法雖然具有檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高的特點(diǎn)，但需要專門的檢測(cè)儀器（普通PCR儀或熒光定量PCR儀)，而環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）由于具有更高的靈敏度和視覺(jué)判斷性的優(yōu)點(diǎn)，且檢測(cè)過(guò)程不需要專門的檢測(cè)儀器，彌補(bǔ)了國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法和PCR方法檢測(cè)沙門氏菌的不足。

沙門氏菌侵襲蛋白（invasion protein）基因簇是沙門氏菌編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白的基因，與沙門氏菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的侵襲有關(guān)，包括invA、invB、invC、invD、invE等基因，其中以invA基因應(yīng)用最為廣泛，目前根據(jù)invA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物已成功應(yīng)用于乳品、肉類、蔬菜等食品中沙門氏菌的檢測(cè)[14,15,21]。本研究根據(jù)沙門氏菌侵襲蛋白A （invA）基因序列設(shè)計(jì)特異性LAMP引物，建立了一種基于顏色判定的簡(jiǎn)單、快速和靈敏的蔬菜栽培土壤中沙門氏菌的快速檢測(cè)方法，對(duì)沙門氏菌純菌檢測(cè)靈敏度可達(dá)7 CFU/25 μL，人工污染的栽培土 壤 樣 品 檢 測(cè) 靈 敏 度 為4×102CFU·g?1。采 用 該LAMP方法與國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法對(duì)比檢測(cè)蔬菜栽培土壤中沙門氏菌污染，結(jié)果表明LAMP檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明該方法能成功應(yīng)用于蔬菜栽培土壤中沙門氏菌的快速檢測(cè)，可為蔬菜栽培土壤中沙門氏菌污染的及時(shí)防控提供技術(shù)支撐。