毛建才，王豪杰，李俊華，翟文強(qiáng)

（新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心，新疆 烏魯木齊 830091）

0 引言

【研究意義】甜瓜蔓枯病是由子囊菌瓜類黑腐小球殼菌（Didymella bryoniae）引起的是一種土傳真菌性病害，是為害甜瓜的主要病害之一，在病害流行時(shí)，瓜田減產(chǎn)可達(dá)30%以上[1]，有報(bào)道稱甜瓜蔓枯病的危害遠(yuǎn)大于甜瓜枯萎病等世界性病害[2]。該病可以自然侵染甜瓜、西瓜和黃瓜等葫蘆科作物，化學(xué)藥劑防治難度較大，目前在全國各個(gè)甜瓜產(chǎn)區(qū)均有分布[3]。由于甜瓜蔓枯病受濕度影響較大，且病原菌寄主范圍廣、傳播途徑多樣、存活時(shí)間長，加之缺乏優(yōu)良的抗病育種材料，所以該病的防治一直是生產(chǎn)上的難題。在病原菌與寄主植物互作中，病原物會(huì)不斷進(jìn)化出強(qiáng)毒力的致病基因來克服寄主的防衛(wèi)反應(yīng)，同樣寄主植物也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的手段來抵御病原物的入侵。因此，從分子生物學(xué)角度研究甜瓜與蔓枯病菌的互作對開發(fā)新的防治方法具有重要意義。高效的遺傳轉(zhuǎn)化方法是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)[2]，為進(jìn)一步明確甜瓜蔓枯病菌的致病機(jī)理，需要建立高效的甜瓜蔓枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，目前大多數(shù)絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化均利用分生孢子作為材料，但甜瓜蔓枯病菌A型菌株在常規(guī)培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生分生孢子，且研究參與病原菌細(xì)胞壁合成的相關(guān)功能基因需要利用原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生進(jìn)行鑒定[4]，因此研究甜瓜蔓枯病菌原生質(zhì)體的制備及再生體系對上述工作具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】原生質(zhì)體是一種有組織且具有細(xì)胞全能性的生活物質(zhì)，它可以在人工操作下進(jìn)行各種分子生物學(xué)操作，如細(xì)胞融合、細(xì)胞壁及完整的植株再生、高分子和病毒的提取等。CaC12/聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)是一種常用的基因功能研究方法，該方法是通過細(xì)胞壁降解酶的消化作用去除細(xì)胞壁獲得原生質(zhì)體，并通過聚乙二醇（PEG）的作用將外源DNA轉(zhuǎn)化整合到原生質(zhì)體的過程。自PEG遺傳轉(zhuǎn)化法在構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中建立以來[5]，禾谷鐮刀 菌 （Fusarium graminearum）、 刺 盤 孢 菌（Colletotrichum fructicola）[6]、楊 樹 腐 爛 病 菌（Cytospora chrysosperma）[7]、 大 麗 輪 枝 菌（Verticillium dahliae）[8]和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）等在甘藍(lán)、西瓜、香蕉專化型[9?11]等多種真菌中建立了轉(zhuǎn)化體系?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管CaC12/PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)以其操作簡便、無需特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)已成為絲狀真菌和植物中常用的轉(zhuǎn)化方法之一，但原生質(zhì)體的產(chǎn)量及再生率仍是制約轉(zhuǎn)化是否高效的關(guān)鍵因素之一[6]。影響原生質(zhì)體制備的條件有很多，如菌絲的菌齡、酶組合、滲透壓穩(wěn)定劑、酶解溫度和時(shí)間等，但不同物種細(xì)胞壁的組分不同，因此不同微生物制備原生質(zhì)體所需要的條件也不盡相同[12]。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究選用2種不同的酶組合，分別在不同菌齡、不同酶解時(shí)間、不同穩(wěn)定劑及pH條件下進(jìn)行原生質(zhì)體的制備和再生體系研究，以期建立高效的甜瓜蔓枯病菌原生質(zhì)體制備和再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 甜瓜蔓枯病菌A型菌株在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈密瓜研究中心試驗(yàn)地采集并分離、鑒定保存。

1.1.2 主要試劑、培養(yǎng)基 甜瓜蔓枯病病原菌生長培養(yǎng)基為PDA（200 g馬鈴薯煮沸20 min后，4層紗布過濾，2%葡萄糖，1.5%～2%瓊脂，補(bǔ)水至1 000 mL，121 ℃高溫高壓滅菌20 min），菌絲搖培培養(yǎng)基為CM液體培養(yǎng)基（0.6% 酵母提取物，0.3% 干酪素水解物，0.3% 酸水解酪蛋白，1% 蔗糖），再生培養(yǎng)基為TB3培養(yǎng)基（0.3% 酵母提取物，0.3% 酪蛋氨基酸，20% 蔗糖，0.7% 瓊脂）和SR培養(yǎng)基（0.1% 酵母提取物，0.1% 酶水解酪蛋白，1 mol·L?1蔗糖，1.5%瓊脂），STC（1.2 mol·L?1山梨醇，10 mmol·L?1Tris-HCl，pH=7.5，50 mmol·L?1氯 化 鈣）。Driselase和Lysing enzymes購自Sigma 公司，Miracloth濾布購自美國C albiochem公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原生質(zhì)體制備 將保存的菌株在PDA培養(yǎng)基上活化，26 ℃黑暗培養(yǎng)5 d。用滅菌的接種針從培養(yǎng)基上刮取活化好的蔓枯病菌菌絲，接種到50 mL帶有5顆玻璃珠的CM液體培養(yǎng)基中，26 ℃、180 r·min?1條件下培養(yǎng)24～42 h[9]，每6 h取樣1次。然后，用滅菌的Miracloth濾布收集菌絲體，收集到的菌絲體先用無菌水沖洗3次，然后用滲透壓穩(wěn)定劑再?zèng)_洗2次。稱取0.5 g沖洗好的菌絲置于50 mL滅菌的三角瓶中（設(shè)置3個(gè)重復(fù)），加入10 mL酶解液（酶解液為20 g·L?1Driselase+8 g·L?1Lysing enzymes，溶劑為0.7 mol·L?1的NaCl，4 ℃，2 000 r·min?1離心10 min后，用0.22 μm微孔濾器除菌），在26～34 ℃、80～200 r·min?1條 件 下 酶 解2～6 h[9,12,13]，之 后 繼 續(xù) 用Miracloth濾布過濾收集原生質(zhì)體，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì) 算原生質(zhì)體個(gè)數(shù)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 原生質(zhì)體再生 采用雙層覆蓋法再生原生質(zhì)體[9]，將收集的原生質(zhì)體離心濃縮，條件為4 ℃、2 000 r·min?1離心10 min，之后用穩(wěn)滲液將原生質(zhì)體含量調(diào)至1×106個(gè)·mL?1，取0.1 mL上述原生質(zhì)體溶液分別均勻涂抹在SR、PDA和TB3固體培養(yǎng)基上[8,9,11]，上層覆蓋55 ℃、0.4%～0.9%瓊脂培養(yǎng)基，搖勻覆蓋，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)；同時(shí)，按上述方法取0.1 mL上述含量的原生質(zhì)體溶液并加入1 mL無菌水，室溫靜置30 min后分別均勻涂布到SR、PDA和TB3固體培養(yǎng)基上作為對照。將上述平板倒置，在28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)3～5 d，至平板表面長出小菌落為止。1.2.3 原生質(zhì)體的保存 用STC溶液純化收集的原生質(zhì)體，將其含量調(diào)整為2×108個(gè)·mL?1，之后加入1/10體積的PEG溶液和1/100體積的DMSO，用移液槍輕輕混勻，分裝于100 μL離心管中，?80 ℃冰箱中保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體制備

2.1.1 菌絲菌齡對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 將菌絲在CM液體培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24、30、36、42、48 h后收集菌絲制備原生質(zhì)體，結(jié)果如圖1所示，用于制備原生質(zhì)體的甜瓜蔓枯病菌菌絲最佳培養(yǎng)時(shí)間為36 h左右，此段時(shí)間獲得的原生質(zhì)體數(shù)量最多，可達(dá)6.04×107個(gè)·mL?1，培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)延長或縮短，原生 質(zhì)體產(chǎn)量均有所下降。

圖 1 菌絲菌齡對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effect of mycelium age on protoplast release by lysis

2.1.2 酶解時(shí)間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 在菌絲菌齡統(tǒng)一為36 h的情況下，計(jì)算酶解2、3、4、5、6 h原生質(zhì)體的產(chǎn)量，明確反應(yīng)時(shí)間對原生質(zhì)體制備的影響。從圖2-A可知，酶解4 h之后，原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高，可達(dá)8.22×107個(gè)·mL?1，酶解時(shí)間過長或過短，原生質(zhì)體的產(chǎn)量均有所下降。但酶促反應(yīng)的時(shí)間在3～5 h，原生質(zhì)體的產(chǎn)量波動(dòng)不大，當(dāng)酶解時(shí)間低于2 h或高于5 h，原生質(zhì)體的產(chǎn)量明顯降低，因此 ，甜瓜蔓枯病菌原生質(zhì)體的最佳酶解時(shí)間為4 h。

2.1.3 酶解溫度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 酶解溫度是影響酶促反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵因素之一，不同的酶具有不同的最適溫度，但是混合酶的最適溫度需要測定。在上述確定的最優(yōu)條件下，設(shè)置24、26、28、30、32、34 ℃為酶解溫度，探討溫度對原生質(zhì)體制備的影響。圖2-B顯示，隨著溫度的升高，原生質(zhì)體的產(chǎn)量逐漸增加，溫度到達(dá)30 ℃時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量最大，為9.65×107個(gè)·mL?1，繼續(xù)提高溫度到32 ℃，原生質(zhì)體的產(chǎn)量略有下降，之后繼續(xù)提高反應(yīng)溫度，原生質(zhì)體產(chǎn)量下降明顯。因此，該結(jié)果說明該酶促反應(yīng)的最適溫度為30 ℃。

圖 2 酶解時(shí)間和酶解溫度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effects of enzymatic digestion time and temperature on protoplast release by lysis

2.1.4 不同滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 滲透壓穩(wěn)定劑在酶促反應(yīng)中的作用主要是維持原生質(zhì)體細(xì)胞內(nèi)外壓力平衡和影響裂解酶的活性，從而最終影響原生質(zhì)體的數(shù)量。在酶濃度、酶解時(shí)間和溫度統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)下，采用0.7 mol·L?1的NaCl、KCl、山梨醇和蔗糖分別作為穩(wěn)滲液[12,14]，統(tǒng)計(jì)甜瓜蔓枯病菌原生質(zhì)體的產(chǎn)量。結(jié)果如圖3-A所示，利用NaCl作為該酶促反應(yīng)的滲透壓穩(wěn)定劑原生質(zhì)體的數(shù)量最多，可達(dá)9.16×107個(gè)·mL?1，其次是KCl溶液。

將NaCl的濃度依次設(shè)置為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mol·L?1，明確不同濃度的NaCl滲透壓穩(wěn)定劑對甜瓜蔓枯病菌原生質(zhì)體制備的影響。由圖3-B可知，利用0.7 mol·L?1的NaCl溶液作為滲透壓穩(wěn)定劑，原生質(zhì)體的產(chǎn)量最多，為8.86×107個(gè)·mL?1，濃度過大或過小，均不利于原生質(zhì)體的釋放。上述結(jié)果說明0.7 mol·L?1的NaCl溶液可以作為甜瓜蔓枯病菌 原生質(zhì)體制備過程中適宜的滲透壓穩(wěn)定劑。

圖 3 滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of osmotic stabilizer on protoplast release by lysis

2.1.5 pH對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 滲透壓穩(wěn)定劑環(huán)境的pH值是影響酶活的一個(gè)主要因素。在上述最優(yōu)條件下，將滲透壓穩(wěn)定劑的pH設(shè)置為4、5、6、7、8、9[7]，比較不同pH條件下甜瓜蔓枯病菌原生質(zhì)體的釋放情況，結(jié)果如圖4-A，當(dāng)pH值為7時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高，可達(dá)8.58×107個(gè)·mL?1，pH值增加或者減小，原生質(zhì)體的數(shù)量都會(huì)下降，由此結(jié)果可知，pH值為7時(shí)，是甜瓜蔓枯病菌制備原生質(zhì)體過 程中的最佳pH。

2.1.6 轉(zhuǎn)速對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 酶解過程中勻速震蕩酶解液是為了使裂解酶與菌絲體充分接觸，有利于加快酶促反應(yīng)的進(jìn)程，保持其他最優(yōu)條件不變，分別設(shè)定轉(zhuǎn)速為80、100、120、140、160、200 r·min?1，計(jì)算轉(zhuǎn)速與原生質(zhì)體的數(shù)量關(guān)系。圖4-B顯示，隨著搖培轉(zhuǎn)速的增加，原生質(zhì)體的釋放速率也在加快，轉(zhuǎn)速為140 r·min?1時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量到達(dá)峰值，為9.60×107個(gè)·mL?1，轉(zhuǎn)速在120～140 r·min?1時(shí)，原生質(zhì)體的生成速率波動(dòng)不大。當(dāng)轉(zhuǎn)速超過160 r·min?1時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量下降且破碎的原生質(zhì)體增多，因此確定原生質(zhì)體制備搖培過程中最佳轉(zhuǎn)速 為120～140 r·min?1。

圖 4 p H和轉(zhuǎn)速對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effects of p H and rotational speed on protoplast yield in lysis

2.2 原生質(zhì)體再生

2.2.1 不同再生培養(yǎng)基對原生質(zhì)體再生率的影響 原生質(zhì)體的再生能力是衡量獲得的原生質(zhì)體質(zhì)量最關(guān)鍵的指標(biāo)，是評價(jià)原生質(zhì)體是否有利用價(jià)值并進(jìn)行下一步遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。分別以PDA、SR和TB3這3種固體培養(yǎng)基作為甜瓜蔓枯病菌原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)基，評價(jià)在該體系中制備的原生質(zhì)體的再生率。圖5-A顯示，蔓枯病菌原生質(zhì)體在SR、PDA和TB3再生培養(yǎng)基生的再生率分別是22.53%、14.78%和22.38%，由此得知，SR和TB3培養(yǎng)基二者差異不顯著，在試驗(yàn)中均可用來高效再生蔓枯病菌原生質(zhì)體。

以SR培養(yǎng)基作為再生培養(yǎng)基，明確上層覆蓋培養(yǎng)基的瓊脂含量對原生質(zhì)體再生率的影響。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)瓊脂含量低于0.5%時(shí)，培養(yǎng)基不易凝固，覆蓋后影響原生質(zhì)體的再生率，覆蓋培養(yǎng)基瓊脂含量在0.5%～0.6%時(shí)，原生質(zhì)體的再生率較高，分別是19.00%和19.67%，二者差異不顯著；瓊脂含量高于0.6%時(shí)，再生率下降（圖5-B）。從上述結(jié)果可知，雙層覆蓋法中上層覆蓋培養(yǎng)基的瓊脂含量對甜瓜蔓枯病菌原生質(zhì)體再生具有明顯影響，覆蓋培養(yǎng)基的瓊脂含量為0.5%～0.6%時(shí)，原生質(zhì)體再生率最高。

圖 5 不同再生培養(yǎng)基對原生質(zhì)體再生率的影響Fig. 5 Effects of medium and agar concentration on protoplast regeneration rate

2.2.2 酶解時(shí)間對原生質(zhì)體再生的影響 在甜瓜蔓枯病菌原生質(zhì)體制備過程中，酶解時(shí)間的長短直接影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量（圖2-A），酶解時(shí)間過短細(xì)胞壁不能被完全酶解，酶解時(shí)間過長又會(huì)破壞原生質(zhì)體的完整性。為了明確酶解時(shí)間是否也影響原生質(zhì)體的再生率，在上述確定的條件下再生原生質(zhì)體，結(jié)果如圖6-A所示，酶解時(shí)間不同，原生質(zhì)體的再生率也不同，酶解4 h，原生質(zhì)體的再生率最高，可達(dá)19.30%，酶解時(shí)間超過4 h后，再生率逐漸下降。因此，酶解時(shí)間的長短會(huì)影響原生質(zhì)體的再生率，綜合原生質(zhì)體的釋放和再生率，甜瓜蔓枯病菌原生質(zhì) 體的最佳酶解時(shí)間是4 h。

圖 6 酶解時(shí)間和存放時(shí)間對原生質(zhì)體再生率的影響Fig. 6 Effects of enzymatic digestion time and storage time on protoplast regeneration rate

2.2.3 原生質(zhì)體的保存時(shí)間與再生率的關(guān)系 將制備的原生質(zhì)體分別保存在?80 ℃冰箱中2、4、6、8、10、12、14 h，之后取出解凍利用SR培養(yǎng)基再生，明確保存時(shí)間對再生率的影響。由圖6-B可知，隨著存放時(shí)間的延長原生質(zhì)體的再生率下降明顯，并且表現(xiàn)為初期下降較為明顯，存放10 h之后，下降趨 勢逐漸平緩，最終維持在10%左右。

3 討論與結(jié)論

優(yōu)化和完善原生質(zhì)體的制備和再生體系，是建立甜瓜蔓枯病菌高效遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的必要條件之一。從本質(zhì)上講，原生質(zhì)體的制備過程是一個(gè)酶促反應(yīng)，影響酶促反應(yīng)的因素主要有酶濃度、酶解時(shí)間、溫度和酶解體系的環(huán)境等，本研究探討甜瓜蔓枯病菌原生質(zhì)體制備和再生的適宜條件，為進(jìn)一步開展甜瓜蔓枯病菌功能基因研究提供技術(shù)支持。

菌齡不同的細(xì)胞，其細(xì)胞壁的薄厚程度和結(jié)構(gòu)也不盡相同。菌絲培養(yǎng)時(shí)間過短，細(xì)胞壁比較幼嫩，形成的原生質(zhì)體大小不一，釋放后更容易被破壞；菌絲培養(yǎng)時(shí)間過長，組織老化，產(chǎn)生對降解酶耐受的結(jié)構(gòu)，不容易被降解，原生質(zhì)體的產(chǎn)量反而下降[14]，因此，要選擇合適菌齡的菌絲體才能制備出高效的原生質(zhì)體。張婷[15]研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉（Aspergillus niger）在培養(yǎng)4 d時(shí)收集菌絲制備的原生質(zhì)體數(shù)量最多；大麗輪枝菌的分生孢子在YPED培養(yǎng)基中搖培18 h產(chǎn)生的菌絲最適宜制備高效的原生質(zhì)體[8]，而馬鈴薯晚疫病菌的最佳菌齡是18 d[16]。不同病原真菌的最佳菌齡各不相同，本研究明確了甜瓜蔓枯病菌制備原生質(zhì)體的最佳菌齡是36 h。

不同病原真菌細(xì)胞壁的組分與結(jié)構(gòu)不盡相同，因此所需的裂解酶也不同。陳孝仁等[17]研究發(fā)現(xiàn)使用Driselase和Lysing enzyme兩種混合酶可產(chǎn)生較多的原生質(zhì)體，楊樹腐爛病菌的原生質(zhì)體制備過程中，利用這兩種混合酶也能產(chǎn)生較多的原生質(zhì)體[7]，本研究中利用20 g·L?1Driselase和8 g·L?1Lysing enzymes兩種混合酶也能起到較好的酶解作用。影響酶促反應(yīng)的另一個(gè)關(guān)鍵因素就是溫度和時(shí)間，溫度過高或過低，均不利于酶促反應(yīng)，一般單一的裂解酶其最適工作溫度都是固定的，但是混合酶的最適溫度就需要測定，本試驗(yàn)中，這兩種混合酶的最適酶解溫度是30 ℃。酶解時(shí)間的長短也直接影響原生質(zhì)體的數(shù)量和質(zhì)量，由于菌絲的菌齡不可能完全一致，在酶解過程中，幼嫩的菌絲首先被酶解釋放出原生質(zhì)體，隨后較老的菌絲才開始產(chǎn)生原生質(zhì)體，所以隨著酶解時(shí)間的延長，原生質(zhì)體的產(chǎn)量不斷增加，但時(shí)間超過達(dá)到4 h后，甜瓜蔓枯病菌原生質(zhì)體的數(shù)量開始下降。這可能是由于先釋放出的原生質(zhì)體長時(shí)間暴露在酶液中，酶液中蛋白酶對原生質(zhì)體膜造成損害而導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂[7?8]。

滲透壓穩(wěn)定劑不僅是維持原生質(zhì)體活力的重要因素，也是發(fā)揮酶活性的重要場所，常用的滲透壓穩(wěn)定劑主要是有機(jī)類化合物和無機(jī)鹽溶液，趙小強(qiáng)[8]的研究發(fā)現(xiàn)大麗輪枝菌制備原生質(zhì)體的最佳滲透壓穩(wěn)定劑是1.2 mol·L?1的KCl溶液，根據(jù)姚婷婷[18]的研究，利用山梨醇作為滲透壓穩(wěn)定劑黑曲霉（Aspergillus niger）原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高，伏建國[14]研究認(rèn)為0.7 mol·L?1的NaCl溶液是鏈格孢菌（Alternaria alternata）的最佳滲透壓穩(wěn)定劑，本研究選用0.7 mol·L?1的NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高。

原生質(zhì)體的再生能力是衡量獲得的原生質(zhì)體質(zhì)量最關(guān)鍵的指標(biāo)，而選擇合適的再生培養(yǎng)基可以有效提高原生質(zhì)體的再生率。在甘藍(lán)枯萎病菌中，利用SR培養(yǎng)基再生原生質(zhì)體再生率可達(dá)21.13%[9]，大麗輪枝菌中SR培養(yǎng)基比PDA更有利于原生質(zhì)體的再生[8]。本研究通過對甜瓜蔓枯病菌原生質(zhì)的再生發(fā)現(xiàn)，SR和TB3培養(yǎng)基對原生質(zhì)體的再生率為22.53%和22.38%，均能作為甜瓜蔓枯病菌原生質(zhì)的再生培養(yǎng)基。