李 聰，田培潔，張 宇，張德詠,，劉 勇,，張松柏, *

（1. 湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410120；3. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

0 引言

【研究意義】煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）屬帚狀病毒科（Vigaviridae）科煙草花葉病毒屬 Tobamovirus病毒，可侵染36個(gè)科的400多種植物，每年給全世界農(nóng)作物造成的經(jīng)濟(jì)損失估計(jì)1億美元以上[1]。TMV的基因組為一條正義單鏈RNA，其基因組長(zhǎng)度約6 400 bp，編碼1個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白；其中TMV P183基因中，編碼一個(gè)假定的P54基因[2]，其功能目前還鮮見報(bào)道。【前人研究進(jìn)展】TMV基因組第一個(gè)核苷酸連有一個(gè)7Gppp的帽子結(jié)構(gòu)，緊接著是一個(gè)含有69個(gè)核苷酸的非翻譯前導(dǎo)序列，編碼TMV復(fù)制所需的專一性復(fù)制酶。從啟動(dòng)子到第一個(gè)終止密碼子可翻譯為P126蛋白，P126蛋白的C端有類似于螺旋酶和甲基轉(zhuǎn)移酶的基本結(jié)構(gòu)[3]，其主要功能是參與TMV復(fù)制。然而僅有P126蛋白存在時(shí)，TMV不能完成復(fù)制，表明TMV還編碼其他蛋白參與其基因組復(fù)制[2]。通讀P126基因的終止密碼子，可翻譯為P183蛋白，P183蛋白具有RNA依賴的RNA聚合酶結(jié)構(gòu)，在TMV侵染后20～30 min就能合成足量的該蛋白，參與TMV基因組RNA復(fù)制，而僅有P183蛋白存在時(shí)，TMV的復(fù)制效率非常低[2]。此外，在這個(gè)讀通區(qū)域中有一個(gè)起始密碼子和一個(gè)開放閱讀框（ORF），編碼了假定的P54蛋白，預(yù)測(cè)其功能與TMV的復(fù)制相關(guān)[4]，然而，P54蛋白的功能，尚無研究證實(shí)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】為研究P54蛋白的功能，需要對(duì)P54蛋白進(jìn)行原核表達(dá)并分離純化，獲得大量的P54蛋白?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究表明，植物病毒編碼的基因，在E coli中原核表達(dá)，通常以包涵體形式存在，包涵體蛋白的復(fù)性純化是獲得有活性純化蛋白的技術(shù)難題[5]。本研究對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性，脫鹽后進(jìn)行分離純化，以期獲得純化的P54重組蛋白，為P54蛋白的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

TMV侵染三生煙（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）葉片，本實(shí)驗(yàn)室保存；HiScript II One Step RT-PCR Kit（Dye Plus）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技公司；原核表達(dá)載體pEASY?-Blunt E1、大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于全式金試劑銷售有限公司（長(zhǎng)沙）；DNA凝膠純化回收試劑盒購(gòu)于OMEGA公司；蛋白純化柱The Thermo Scientific?HisPur ? Ni-NTA Spin Columns、一 抗6x-His Tag Monoclonal Antibody（HIS.H8）、二抗Goat anti-Mouse IgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary Antibody，HRP購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒構(gòu)于北京索萊寶生物公司。

1.2 RNA抽提及RT-PCR

三生煙葉片總RNA抽提采用TrazoL法[6]。TMV P54基因的特異性RT-PCR擴(kuò)增引物以TMV基因組（Genbank登錄號(hào)：HE818438.1）為模板設(shè)計(jì)，添加雙酶切位點(diǎn)（下劃線）和保護(hù)堿基（TMV/rdrp/sacI/F：5′＞ACCGAGCTCATGCAGTTTTACTATGATAAGTG TC＜3′，TMV/rdrp/xhoI/R：5′＞CCCCTCGAGACAAC TAGAGCCATCTATAAACAA＜3′,）。

以抽提的感染TMV三生煙總RNA為模板，P54基因特異性引物采用一步法進(jìn)行RT-PCR[7]，PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物采用DNA凝膠純化回收試劑盒（OMEGA公司）回收純化。

1.3 重組原核表達(dá)載體構(gòu)建

用PCR產(chǎn)物和pEASY?-Blunt E1，采用DNA凝膠純化回收試劑盒（OMEGA公司）回收純化PCR產(chǎn)物，將純化回收后的PCR產(chǎn)物連接至pEASY?-Blunt E1中。將連接好的載體轉(zhuǎn)化至E coli DH5α，以原核表達(dá)載體pEASY?- Blunt E1試劑盒自帶T7引物進(jìn)行PCR菌落鑒定，PCR產(chǎn)物委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.4 TMV P54基因的原核表達(dá)條件優(yōu)化

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pEASY?-Blunt E1::P54轉(zhuǎn)入E coli BL21（DE3）中，分別使用0.1、0.4、0.8和1.2 mmol·L?1異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-Dthiogalactoside，IPTG）于28、37 ℃培養(yǎng)4 h進(jìn)行蛋白的表達(dá)及條件優(yōu)化。吸取2 mL培養(yǎng)物，用高速低溫離心機(jī)12 000 g，4 ℃，離心10 min收集菌體提取總蛋白。

1.5 原核表達(dá)蛋白提取純化

將 菌 體 收 集 懸 浮 于 裂 解 緩 沖 液（50 mmol·L?1Tris-HCl，50 mmol·L?1NaCl，pH 8.0）中，超聲破碎細(xì)胞（功率400 W，工作4 s，間歇4 s，共30 min）。破碎后菌液用高速低溫離心機(jī)12 000 g，4 ℃，離心10 min，取上清20 μL，沉淀用1×PBS懸浮后取20 uL；上清液和懸浮后沉淀用于SDS-PAGE鑒定。包涵體蛋白純化參照The Thermo Scientific? HisPur?Ni-NTA Spin Columns操作說明進(jìn)行，并將收集到的液體裝入透析袋，于8、6、4、2、0 mol·L?1尿素的梯度透析液（5%甘油、1% L-精氨酸、2% 甘氨酸、1×PBS，pH 8.0）中，于各個(gè)梯度透析液中4 ℃下透析復(fù)性12 h以上，收集液用高速低溫離心機(jī)12 000 g，4 ℃，離心10 min，保留上清，去除沉淀，純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.6 Western blotting檢測(cè)

將純化后的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，4 ℃一抗（6x-His Tag Monoclonal Antibody（HIS.H8）from Thermo Fisher Scientific）孵育過夜，清洗PVDF膜；于37 ℃進(jìn)行二抗（Goat anti-Mouse IgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP from Thermo Fisher Scientific）孵育，清洗PVDF膜，用Thermo Scientific? Pierce?ECL Plus Western Blotting Substrate顯色試劑盒進(jìn)行顯色檢測(cè)[8]。

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以感染TMV三生煙的總RNA為模版，RT-PCR擴(kuò)增TMV P54基因，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增得到1條大小約為1.5 kbp特異性條帶（圖1-A），純化回收后測(cè)序結(jié)果表明，該條帶大小為1 425 bp，與TMV P54基因的同源性高達(dá)100%。

圖 1 原核表達(dá)載體p EASY?- Blunt E1::P54凝膠電泳分析Fig. 1 Electrophoresis of recombinant prokaryotic expressing plasmid, pEASY-Blunt E1::P54

將P54基因條帶雙酶切后，插入雙酶切的pEASY?-Blunt E1，轉(zhuǎn)化E coli BL21（DE3）。菌落PCR擴(kuò)增得到了與預(yù)期大小一致的特異性條帶（圖1-B），表 明原核表達(dá)載體pEASY?-Blunt E1::P54構(gòu)建成功。

2.2 P54基因的原核表達(dá)及蛋白鑒定

將含重組質(zhì)粒pEASY?-Blunt E1::P54的E coli BL21（DE3），在37 ℃，0.5 mmol·L?1IPTG誘導(dǎo)4 h，分別取上清與沉淀，SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果表明，37 ℃，0.5 mmol L?1IPTG誘導(dǎo)4 h，在55～70 kDa出現(xiàn)特異性目的條帶（圖2），即重組P54蛋白，并且重組E1-P54蛋 白大部分表達(dá)于包涵體中。

2.3 P54原核表達(dá)條件的優(yōu)化

為了探究P54蛋白原核表達(dá)的最優(yōu)條件，對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。分別利用0.1、0.4、0.8、1.2 mmol·L?1IPTG于28、37 ℃培養(yǎng)4 h。SDS-PAGE 電泳顯示（圖3），在28、37 ℃時(shí)，大腸桿菌的上清蛋白中均未發(fā)現(xiàn)目的條帶（泳道1～4，9～12）。在大腸桿菌的沉淀蛋白中出現(xiàn)了目的條帶（泳道5～8，13～16），且在37 ℃下誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)量高于在28 ℃；IPTG濃度超過0.4 mmol·L?1后，目的條帶無明顯變化；表明P54蛋白的最佳誘導(dǎo)溫度與最佳IPTG濃度分 別為37 ℃、0.4 mmol L?1。

2.4 重組蛋白P54的純化與蛋白濃度測(cè)定

重組P54蛋白包涵體經(jīng)過過柱純化，透析復(fù)性，SDS-PAGE結(jié)果表明，純化蛋白在55～70 kDa出現(xiàn)了1條與預(yù)測(cè)大小一致特異的蛋白條帶（圖4）。純化后的蛋白濃度測(cè)定參照索萊寶BCA試劑盒進(jìn)行，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.46x+0.06, R2=0.94），計(jì)算純 化后蛋白含量為0.29 mg· mL?1。

圖 2 P54蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis on induced expression products of P54

圖 3 TMV P54基因表達(dá)條件優(yōu)化（A：28 ℃，B：37 ℃）Fig. 3 SDS-PAGE analysis on prokaryotic expressing of TMV P54 (A: 28 ℃; B: 37 ℃)

2.5 P54重組蛋白的Western blot鑒定

純化后的P54重組蛋白，采用6×His單克隆抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果表明，純化后的重組P54蛋白，與6×His單克隆抗體與雜交條帶，證 實(shí)純化后的重組蛋白為P54重組蛋白（圖5）。

3 討論與結(jié)論

將TMV P54基因序列插入到原核表達(dá)載體pEASY-Blunt E1，在宿主菌E coli BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，TMV P54蛋白主要以包涵體形式存在。包涵體復(fù)性后，透析復(fù)性后采用Ni-NTA柱層析純化，SDS-PAGE及Western-blotting證實(shí)純化得到了分子量大小約為60 kDa的P54重組蛋白，為大量表達(dá)P54蛋白，研究其生物學(xué)特性打下了基礎(chǔ)。

圖 4 純化TMV P54重組蛋白SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis on purified TMV P54

圖 5 純化TMV P54重組蛋白Western blotting分析 Fig. 5 Western blot on purified TMV P54

TMV的基因組復(fù)制研究表明，TMV編碼P183和P126蛋白，參與TMV的復(fù)制[9,10,11,12]，此外，TMV還編碼一個(gè)假定的P54蛋白，預(yù)測(cè)其功能與TMV的復(fù)制相關(guān)[4]，但尚無相關(guān)研究證實(shí)。有研究表明受染植物細(xì)胞的多聚核糖體中，可以檢測(cè)到P54基因的mRNA，卻未檢測(cè)到P54蛋白[13]。推測(cè)P54蛋白可能是一個(gè)特定時(shí)間表達(dá)蛋白，但目前尚無研究證實(shí)。因此，急需開展TMV編碼P54蛋白功能研究，為研究明確TMV復(fù)制分子機(jī)制提供科學(xué)基礎(chǔ)。

采用原核表達(dá)技術(shù)，純化獲得大量表達(dá)目標(biāo)蛋白，是研究目標(biāo)蛋白生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，影響外源蛋白原核表達(dá)水平及其生物活性的因素有多種，如目標(biāo)蛋白自身編碼基因、表達(dá)宿主菌以及誘導(dǎo)表達(dá)的條件等[14,15]。植物病毒編碼蛋白的原核表達(dá)研究表明，原核表達(dá)的植物病毒編碼蛋白，通常以包涵體形式存在[5]，本研究結(jié)果得到類似結(jié)果，P54蛋白以包涵體形式存在。此外，溫度會(huì)顯著影響原核蛋白的表達(dá)，在高溫誘導(dǎo)時(shí)，大腸桿菌的生長(zhǎng)速度較快，蛋白表達(dá)的速度會(huì)隨之增快，導(dǎo)致表達(dá)的蛋白不能正確折疊，易形成包涵體[16,17]。在28 ℃和37 ℃，原核表達(dá)的P54蛋白均以包涵體的形式存在，表明P54蛋白形成包涵體，可能與蛋白的不能正確折疊無關(guān)，而與蛋白本身特性有關(guān)。

原核表達(dá)的蛋白包涵體，可復(fù)性恢復(fù)生物學(xué)活性[18]，本研究采用鹽酸胍對(duì)P54重組蛋白進(jìn)行復(fù)性，并透析濃縮去掉鹽離子，獲得了純度和濃度均較高的重組蛋白，為后續(xù)深入研究煙草花葉病毒P54蛋白功能奠定基礎(chǔ)。