魏超平，張芳萍，孫裕平

(山東省青島市婦女兒童醫(yī)院：1.NICU；2.神經(jīng)內(nèi)科 266000)

新生兒窒息由于腦組織嚴重受損可引發(fā)包括窒息后缺氧缺血性腦病(HIBD)在內(nèi)的腦部疾病，臨床表現(xiàn)為神經(jīng)發(fā)育異常、中樞神經(jīng)運動障礙、智力低下及視聽障礙等[1-2]。相關(guān)文獻顯示，我國每年嚴重腦損傷新生兒超過60萬，致殘率高達27%以上，嚴重威脅新生兒健康及社會人口素質(zhì)[3]。生物標志物檢測作為一種與細胞生長及增殖相關(guān)的新興檢測技術(shù)受到越來越多的關(guān)注。神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細胞攜帶的細胞骨架蛋白，是星形膠質(zhì)細胞特征性標志物。在新生兒窒息后HIBD中，神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞均會受到不同程度損傷。泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)則是一類神經(jīng)元細胞高特異性表達蛋白[4-5]。本研究旨在通過應(yīng)用UCH-L1和GFAP水平評估新生兒窒息后HIBD的預(yù)后，為臨床診療提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2019年1月本院收治的新生兒窒息后HIBD患兒120例。納入標準：(1)符合《新生兒窒息診斷和分度標準建議(2013年版)》規(guī)定的HIBD相關(guān)診斷標準[6]；(2)胎齡34～39周，出生體重大于2 500 g。排除標準：(1)伴隨感染性疾病、先天性心臟病、神經(jīng)系統(tǒng)畸形；(2)低血糖腦病或膽紅素腦病等其他原因造成的腦損傷。根據(jù)臨床檢查及顱腦超聲結(jié)果將HIBD患兒分為輕度組(意識清醒，無腦細胞損傷，腦電圖正常，n=61)、中度組(意識遲鈍、肌張力低下，中度腦細胞損傷、腦水腫，部分有顱內(nèi)出血，n=34)和重度組(生后即有淺昏迷或昏迷，呼吸暫停，肌張力松弛，皮層腦細胞嚴重損傷或壞死，伴有顱內(nèi)出血，n=25)。其中，輕度組：男30例，女31例；胎齡35～39周，平均(38.22±5.35)周。中度組：男19例，女15例；胎齡34～39周，平均(38.31±5.44)周。重度組：男14例，女11例；胎齡34～39周，平均(38.16±5.74)周。另選取同期健康新生兒115例作為對照組，其中，男58例，女57例，胎齡35～39周，平均(38.78±6.44)周。4組新生兒性別、胎齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1標本采集及檢測

采集4組新生兒出生后6 h、3 d外周靜脈血3 mL，3 000 r/min離心15 min，收集上清液置于-70 ℃待測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測UCH-L1、GFAP水平。(1)UCH-L1檢測：試劑盒購自美國SANTA CRUZ公司，檢測儀器采用美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的Bio-Rad 680酶標儀。將待測樣品用稀釋液C稀釋至合適濃度，將不同濃度標準品及待測血清樣品取100 μL加入孔板，室溫孵育2.5 h；每孔加入洗滌液300 μL充分洗滌后吸去液體，每孔繼續(xù)加入備用生物素標記的抗UCH-L1抗體100 μL，室溫孵育1 h，充分洗滌后依次加入Item G、Item H，最后加入終止液；盡快將孔板置于酶標儀，波長選擇450 nm，檢測各孔吸光度值，UCH-L1測定范圍為0.50～180.00 ng/mL，正常參考值為0.70～1.10 ng/mL。(2)GFAP檢測：試劑盒及檢測儀器同上。使用檢測緩沖液將待測樣品稀釋，將稀釋樣品取100 μL加入孔板，同時設(shè)置一系列標準品孔，室溫下孵育2 h，洗滌液充分洗滌后，每孔依次加入抗GFAP抗體、酶溶液、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液及終止液，待溶液由藍變黃后置于酶標儀下檢測，測試波長450 nm，GFAP測定范圍為0.03～50.00 ng/mL。正常參考值為0.10～1.20 ng/mL

1.2.2觀察指標

(1)比較有、無HIBD后遺癥患兒出生后6 h、3 d的血清UCH-L1、GFAP水平；(2)采用受試者工作特征(ROC)曲線評估血清UCH-L1、GFAP對新生兒窒息后HIBD早期預(yù)測價值；(3)新生兒出生后6 h、3 d的血清UCH-L1、GFAP與Gesell發(fā)育量表(GDS)評分相關(guān)性分析。

1.2.3隨訪

HIBD患兒給予相應(yīng)治療，好轉(zhuǎn)出院后進行為期12個月的隨訪，隨訪內(nèi)容包括神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)、視力聽力檢查、生長發(fā)育指標等，評估其是否出現(xiàn)后遺癥。隨訪12個月后，采用GDS對患兒神經(jīng)功能檢查進行評估[7]，發(fā)育商小于或等于75分提示患兒出現(xiàn)智力殘疾，或癲癇發(fā)作，可視為發(fā)生后遺癥。根據(jù)是否發(fā)生后遺癥將HIBD患兒分為無后遺癥組和有后遺癥組。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 4組新生兒不同時間UCH-L1、GFAP水平比較

出生后6 h、3 d，4組新生兒血清UCH-L1、GFAP水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中，HIBD重度組血清UCH-L1、GFAP水平在出生后6 h、3 d均最高，對照組水平最低，各組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；輕度組、中度組、重度組在生后3 d血清UCH-L1水平明顯低于生后6 h，而血清GFAP水平明顯高于生后6 h(P<0.05)，見表1。

表1 4組新生兒出生后6 h、3 d的UCH-L1和GFAP水平比較

2.2 有、無后遺癥患兒UCH-L1、GFAP水平比較

隨訪12個月，120例HIBD患兒中無后遺癥86例(無后遺癥組，71.67%)，GDS評分為(80.62±7.71)分；有后遺癥34例(有后遺癥組，28.33%)，GDS評分為(73.45±7.38)分，兩組患兒GDS評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。有后遺癥組血清UCH-L1、GFAP水平在出生后6 h、3 d均明顯高于無后遺癥組(P<0.05)，見表2。

表2 有、無后遺癥患兒UCH-L 1、GFAP水平比較

2.3 血清UCH-L1、GFAP對HIBD早期預(yù)測價值

出生后6 h血清UCH-L1預(yù)測新生兒窒息后HIBD的靈敏度為85.34%，特異度為88.93%，曲線下面積(AUC)為0.916(95%CI：0.870～0.962，P=0.028)；出生后6 h血清GFAP預(yù)測新生兒窒息后HIBD的靈敏度為81.27%，特異度為83.61%，AUC為0.872(95%CI：0.714～0.896，P=0.013)，見圖1。

圖1 血清UCH-L 1、GFAP預(yù)測新生兒窒息后 HIBD ROC曲線

2.4 血清UCH-L 1、GFAP水平與GDS評分相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，出生后6 h新生兒血清UCH-L1、GFAP水平與GDS評分呈負相關(guān)(r=-0.576，P=0.001；r=-0.739，P=0.014)；出生后3 d血清UCH-L1、GFAP水平與GDS評分呈負相關(guān)(r=-0.626，P<0.001；r=-0.457，P=0.003)。

3 討 論

HIBD是導致圍生期新生兒腦損傷的常見疾病，目前HIBD造成的腦損傷主要依賴病史、體格檢查，結(jié)合磁共振成像(MRI)或頭顱CT等檢查確定[8]。不同的檢測方法有著不同的限制性，如體格檢查存在偏高的假陰性率；MRI或CT不僅價格昂貴，還需要患兒保持一定時間的鎮(zhèn)靜狀態(tài)，并使得患兒接受多次電離輻射存在二次腦損傷的可能，且影像學改變無法準確預(yù)測腦功能改變，部分神經(jīng)影像學檢測正常而患兒臨床癥狀卻較為嚴重[9]。因此，尋找合適的HIBD腦損傷生物標志物以期更早地發(fā)現(xiàn)新生兒腦損傷具有十分重要的意義。

UCH-L1是一種高度特異性表達在神經(jīng)元細胞的蛋白，其在血液中的水平升高通常與腦神經(jīng)細胞損傷或血腦屏障破壞有關(guān)。UCH-L1升高已被普遍認為是包括早期重型顱腦損傷及急性腦缺血性疾病在內(nèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的標志物[10]。黃瑋玲等[11]將130例早產(chǎn)兒分為腦白質(zhì)損傷組、腦室周圍-腦室內(nèi)出血組及無腦損傷組，比較各組血清UCH-L1水平發(fā)現(xiàn)，腦白質(zhì)損傷組、腦室周圍-腦室內(nèi)出血組血清UCH-L1水平均明顯高于無腦損傷組。WELCH等[12]對251例輕度創(chuàng)傷性腦損傷患者進行研究分析，發(fā)現(xiàn)相較于S100B蛋白，血清UCH-L1識別正常、異常CT表現(xiàn)的靈敏度、特異度均更優(yōu)。GFAP是一種特異性酸性蛋白，多存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)，被認為是該細胞的特有標志物，在維持細胞形態(tài)及功能上均有重要作用，當中樞神經(jīng)受損后，星形膠質(zhì)細胞活化增生，GFAP迅速合成，體內(nèi)水平隨之升高[13]。陳長春等[14]研究發(fā)現(xiàn)，足月新生兒HIBD發(fā)病后不同時間、不同嚴重程度腦脊液GFAP水平均存在差異。不過腦脊液需腰椎穿刺獲取，相關(guān)報道并不多。但動物模型顯示，腦損傷小鼠腦組織的UCH-L1及GFAP表達較對照組明顯升高[15]。

基于以往研究基礎(chǔ)，為了進一步探究血清UCH-L1和GFAP水平對新生兒窒息后HIBD的影響及早期預(yù)測價值，本研究將120例HIBD患兒分為輕度組、中度組及重度組，并與同期健康新生兒作比較，結(jié)果顯示，出生后6 h、3 d，對照組、輕度組、中度組、重度組血清UCH-L1、GFAP水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中，HIBD重度組血清UCH-L1、GFAP水平在出生后6 h、3 d均最高，對照組水平最低；輕度組、中度組、重度組血清UCH-L1水平在出生后3 d明顯較出生后6 h降低(P<0.05)，血清GFAP水平較出生后6 h明顯升高(P<0.05)。提示腦損傷早期神經(jīng)元受到一定影響，星形膠質(zhì)細胞參與了HIBD病理、生理早期修復，血清UCH-L1在出生3 d后較出生6 h時降低，可能是由于出生后患兒腦神經(jīng)元細胞破壞逐漸緩解，釋放的血清UCH-L1開始減少[16]；而GFAP在出生3 d后較出生后6 h時升高，可能是由于星形膠質(zhì)細胞后期仍處于活化狀態(tài)起著修復作用。經(jīng)過為期12個月的隨訪，有后遺癥組患兒血清UCH-L1、GFAP水平在出生后6 h、3 d均明顯高于無后遺癥組。提示血清UCH-L1、GFAP與HIBD患兒預(yù)后有一定關(guān)系。出生后6 h血清UCH-L1、GFAP預(yù)測新生兒HIBD的靈敏度分別為85.34%、81.27%，特異度分別為88.93%、83.61%，AUC分別為0.916、0.872；出生后6 h、3 d新生兒血清UCH-L1、GFAP水平與GDS評分均呈負相關(guān)(P<0.05)。

綜上所述，血清UCH-L1、GFAP在HIBD患兒出生后6 h即明顯升高，其水平與患兒腦損傷嚴重程度及預(yù)后有一定關(guān)系，對HIBD新生兒進行UCH-L1、GFAP檢測有助于作出早期腦損傷判斷，可為臨床后續(xù)治療提供參考依據(jù)。