劉 牧，楊夏茵，薄海美

(1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，河北唐山 063000 ；2.華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院心血管，河北唐山 063000)

急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)是一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，主要由T細(xì)胞惡性克隆性增殖轉(zhuǎn)化所導(dǎo)致，分別占兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、成人ALL患者的10%～15%、25%[1]；目前，化療是T-ALL治療的主要方式，但生存率和預(yù)后效果均不太理想[2]。微小RNA(miRNA)是細(xì)胞內(nèi)重要的一類基因調(diào)控因子，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。miR-27a-3p是一種與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的miRNA，可通過調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡等在膀胱癌、乳腺癌和胃癌等癌癥中發(fā)揮著重要的抑癌或致癌作用[3-5]。有研究指出，miR-27a-3p在兒童ALL患者血漿和T-ALL細(xì)胞中均呈低表達(dá)，且miR-27a-3p在前者中可能發(fā)揮著重要的抑癌作用，但其在后者中的作用機(jī)制并不清楚[6-7]。本研究以T-ALL細(xì)胞系Jurkat為研究對象，觀察miR-27a-3p對Jurkat細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的分子機(jī)制，以期為T-ALL的發(fā)病機(jī)制提供新線索。

1 材料與方法

1.1 材料

人T-ALL細(xì)胞系Jurkat(美國ATCC，編號(hào)：GD-C24419605)，噻唑藍(lán)(MTT)試劑、二甲基亞砜(大連寶生物，編號(hào)：M8180、D8371)，胎牛血清(杭州四季青生物工程公司，編號(hào)：11011-6123)，脂質(zhì)體(Lipofectamine)2000和Trizol試劑(美國Invitrogen，編號(hào)：11668、15596026)，RPMI-1640培養(yǎng)基、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3活性檢測試劑盒和雙熒光素酶報(bào)告基因(DLR)檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，編號(hào)：31800、CA1020、BC3830、D0010)，BeyoRTTMII cDNA合成試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，編號(hào)：D7170M)，熒光定量PCR試劑盒(杭州主諾生物，編號(hào)：RT0411-01)，B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)基因、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、X染色體連鎖的凋亡抑制基因(XIAP)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(美國Abcam，編號(hào)：ab185002、ab32503、ab28151、ab181602)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組與轉(zhuǎn)染

采用含100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞。將對數(shù)生長期Jurkat細(xì)胞按照每孔2×105個(gè)種植到6孔細(xì)胞板上后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為未轉(zhuǎn)染組(未處理)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染陰性對照miR-NC)和miR-27a-3p組(轉(zhuǎn)染miR-27a-3p模擬物)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說明書根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組將miR-27a-3p模擬物及其陰性對照轉(zhuǎn)染至Jurkat細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；收集培養(yǎng)48 h后的Jurkat細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-27a-3p表達(dá)

采用Trizol法提取Jurkat細(xì)胞總RNA后，按照cDNA合成試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA。以cDNA為模板，在20 μL反應(yīng)體系下按照設(shè)定的反應(yīng)條件于ABI7500熒光擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以U6為管家基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Jurkat細(xì)胞中miR-27a-3p表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。其中，反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃ 變性30 s、60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。生工生物工程(上海)股份公司合成的引物序列如下：miR-27a-3p正向：5′-ACA CTC CAG CTG GGT TCA CAG TGG CTA AG-3′，反向：5′-TGG TGT CGT GGA GTC G-3′；U6正向：5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3′，反向：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′。

1.2.3MTT法檢測細(xì)胞增殖

將對數(shù)生長期Jurkat細(xì)胞按照每孔5×104個(gè)種植到96孔板上后，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)；待細(xì)胞達(dá)70%匯合度達(dá)時(shí)，根據(jù)1.2.1中的分組將miR-27a-3p模擬物及其陰性對照miR-NC轉(zhuǎn)染至Jurkat細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，每孔加入MTT試劑(5 mg/mL)10 μL；孵育4 h后，每孔加入150 μL二甲基亞砜；震蕩反應(yīng)至結(jié)晶充分溶解后，采用WD-2102B型全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測HCCLM3細(xì)胞在450 nm處的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

收集轉(zhuǎn)染48 h后的miR-27a-3p組、miR-NC組和正常培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)染組Jurkat細(xì)胞，以預(yù)冷的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞2次，1 000 r/min離心5 min，加入1×Binding Buffer 300 μL懸浮細(xì)胞后，先后加入Annexin V-FITC和PI工作液各5 μL，混勻后避光下室溫孵育15 min后，于1 h內(nèi)上FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Western blot檢測細(xì)胞中Bcl-2、XIAP、Bax蛋白表達(dá)

向轉(zhuǎn)染48 h后的miR-27a-3p組、miR-NC組和正常培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)染組Jurkat細(xì)胞中加入裂解液于冰上裂解30 min抽提細(xì)胞總蛋白后，采用二喹啉甲酸法檢測蛋白濃度與純度。按照體積比4∶1將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混勻后，置于沸水浴中煮沸5 min。在12%聚丙烯酰胺凝膠中，每孔50 μg上樣蛋白樣品；電泳分離結(jié)束后，采用半干法將蛋白樣品轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上。室溫下，以5%脫脂奶粉封閉1.5 h后，加入1∶1 000稀釋的一抗于4 ℃下孵育過夜。經(jīng)1∶5 000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h后，加入化學(xué)發(fā)光劑顯影、曝光。以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J軟件掃描分析Jurkat細(xì)胞中Bcl-2蛋白、XIAP蛋白、Bax表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6比色法檢測細(xì)胞caspase-3活性

收集轉(zhuǎn)染48 h后的miR-27a-3p組、miR-NC組和正常培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)染組Jurkat細(xì)胞，加入裂解液100 μL裂解細(xì)胞15 min后，在4 ℃條件下1 000 r/min離心10 min，經(jīng)收集到的蛋白樣品定量后，按照caspase-3活性檢測試劑盒說明書檢測Jurkat細(xì)胞caspase-3活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7DLR實(shí)驗(yàn)檢測miR-27a-3p和XIAP的靶向關(guān)系

采用Targetscan軟件預(yù)測到miR-27a-3p與XIAP 3′端非編碼區(qū)(UTR)存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。將野生型XIAP 3′UTR序列和定點(diǎn)突變后的XIAP 3′UTR序列克隆重組至DLR載體質(zhì)粒上，分別記為XIAP-Wt和XIAP-Mut載體質(zhì)粒。將構(gòu)建的載體質(zhì)粒按照Lipofectamine 2000說明書分別與miR-27a-3p模擬物及其陰性對照miR-NC共轉(zhuǎn)染至Jurkat細(xì)胞中，其中每個(gè)處理設(shè)3個(gè)復(fù)孔；根據(jù)DLR檢測試劑盒說明書檢測Jurkat細(xì)胞的熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞中miR-27a-3p表達(dá)水平比較

未轉(zhuǎn)染組、miR-NC組、miR-27a-3p組細(xì)胞中miR-27a-3p表達(dá)水平分別為1.02±0.08、0.97±0.06、17.38±2.05。與未轉(zhuǎn)染組比較，miR-NC組Jurkat細(xì)胞中miR-27a-3p表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與miR-NC組或未轉(zhuǎn)染組比較，miR-27a-3p組Jurkat細(xì)胞中miR-27a-3p表達(dá)水平明顯升高(F=573.59，P<0.01)。

2.2 miR-27a-3p過表達(dá)對Jurkat細(xì)胞增殖的影響

與未轉(zhuǎn)染組或miR-NC組比較，miR-27a-3p組Jurkat細(xì)胞增殖活力明顯降低(P<0.05)；而miR-NC組和未轉(zhuǎn)染組Jurkat細(xì)胞增殖活力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖活力比較

2.3 miR-27a-3p過表達(dá)對Jurkat細(xì)胞凋亡的影響

未轉(zhuǎn)染組、miR-NC組、miR-27a-3p組細(xì)胞凋亡率分別為(8.65±1.13)%、(9.18±1.35)%、(18.36±3.02)%。與未轉(zhuǎn)染組比較，miR-NC組Jurkat細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但miR-27a-3p組Jurkat細(xì)胞凋亡率較未轉(zhuǎn)染組或miR-NC組明顯升高(F=65.858，P<0.001)。流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡結(jié)果，見圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡結(jié)果

2.4 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2等蛋白表達(dá)水平及caspase-3活性比較

與未轉(zhuǎn)染組比較，miR-NC組Jurkat細(xì)胞中Bcl-2蛋白、XIAP蛋白、Bax表達(dá)水平和caspase-3活性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但miR-27a-3p組Jurkat細(xì)胞中Bcl-2和XIAP蛋白表達(dá)水平明顯低于未轉(zhuǎn)染組或miR-NC組，而Bax表達(dá)水平和caspase-3活性明顯高于未轉(zhuǎn)染組或miR-NC組(P<0.05)，見圖2、表2。

圖2 Western blot檢測Bcl-2蛋白、XIAP蛋白、Bax表達(dá)

2.5 miR-27a-3p和XIAP靶向關(guān)系的驗(yàn)證

miR-27a-3p和XIAP之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，miR-27a-3p模擬物與XIAP-Wt共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的熒光素酶活性較miR-NC與XIAP-Wt共轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯降低(P<0.05)，但miR-27a-3p模擬物對轉(zhuǎn)染XIAP-Mut細(xì)胞的熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，見圖3、表3。

表2 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2等蛋白表達(dá)水平及caspase-3活性比較

圖3 miR-27a-3p和XIAP之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)

表3 各組細(xì)胞熒光素酶活性比較

3 討 論

miRNAs是一類長約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可通過與靶基因mRNA堿基互補(bǔ)配對的方式負(fù)向調(diào)控mRNA表達(dá)，在細(xì)胞增殖和凋亡等生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究表明，在T-ALL發(fā)生、發(fā)展過程中存在著異常表達(dá)的miRNAs，而部分miRNAs如miR-181a-5p、miR-452和miR-664等可通過調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡等發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[8-11]。隨著研究的不斷深入，越來越多的miRNAs在T-ALL發(fā)生、發(fā)展中的作用被發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)，但還有部分miRNAs的作用并不清楚。

miR-27a-3p是miRNAs家族成員，定位于人19號(hào)染色體上，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切聯(lián)系[5]。在非小肺癌細(xì)胞中miR-27a-3p發(fā)揮著抑癌作用，miR-27a-3p過表達(dá)可通過靶向調(diào)控HOXB8表達(dá)抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]；另外，miR-27a-3p過表達(dá)還可通過改變細(xì)胞周期分布抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。miR-27a-3p在部分腫瘤發(fā)生、發(fā)展中除了發(fā)揮抑癌作用外，還可能在其他腫瘤中發(fā)揮著致癌作用。例如：在結(jié)直腸癌中miR-27a-3p可通過靶向調(diào)控抑癌基因B細(xì)胞易位基因1(BTG1)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡[14]。miR-27a-3p是一種與ALL密切相關(guān)的miRNA[6-7]，但其具體的調(diào)控作用及機(jī)制并不明確。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-27a-3p模擬物成功上調(diào)miR-27a-3p表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，T-ALL Jurkat細(xì)胞增殖活力明顯減弱。結(jié)果表明，miR-27a-3p過表達(dá)可抑制Jurkat細(xì)胞增殖。Bcl-2蛋白和Bax是Bcl-2蛋白家族成員，在T-ALL細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的抑制和促進(jìn)作用[15-16]。caspase-3是caspase家族成員，在T-ALL細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著執(zhí)行因子的作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a-3p過表達(dá)后Jurkat細(xì)胞凋亡率明顯升高，同時(shí)細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯減弱，而Bax表達(dá)水平及caspase-3活性均明顯升高。說明miR-27a-3p過表達(dá)可誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，提示miR-27a-3p可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡在T-ALL惡性進(jìn)展中發(fā)揮著重要的抑制作用。

XIAP蛋白是一種重要的抑制凋亡蛋白，屬于人類凋亡抑制蛋白家族成員，可有效阻斷caspase活性抑制細(xì)胞凋亡[18]。研究顯示，XIAP在T-ALL細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[19]，而抑制XIAP表達(dá)具有抑制T淋巴瘤Jurkat細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[20]。為了進(jìn)一步探討miR-27a-3p調(diào)控T-ALL細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制，本研究采用生物信息學(xué)軟件對miR-27a-3p的潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測，最終將XIAP作為研究對象；miR-27a-3p與XIAP 3′UTR之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)；DLR實(shí)驗(yàn)檢測證實(shí)miR-27a-3p可與XIAP靶向結(jié)合；同時(shí)，在miR-27a-3p過表達(dá)的Jurkat細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)XIAP蛋白表達(dá)下調(diào)。結(jié)果表明，XIAP是miR-27a-3p的靶基因，miR-27a-3p可負(fù)向調(diào)控XIAP表達(dá)，提示miR-27a-3p可能通過靶向調(diào)控XIAP表達(dá)抑制T-ALL細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-27a-3p可抑制Jurkat細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與靶向調(diào)控XIAP表達(dá)有關(guān)。本研究初步揭示了miR-27a-3p在T-ALL惡性進(jìn)展中的抑制作用，并首次證實(shí)了miR-27a-3p和XIAP的靶向關(guān)系；然而，miR-27a-3p抑制T-ALL發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制還可能與其他機(jī)制有關(guān)，還有待后續(xù)進(jìn)一步探討。