焦 潔，妙 苗，王 濤，蔡 虎

（陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院·國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品微生物檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710065）

長(zhǎng)春西汀注射液是由主藥長(zhǎng)春西汀和輔料山梨醇、苯甲醇等經(jīng)現(xiàn)代工藝精制而成的無(wú)菌注射液，臨床主要用于改善腦梗死后遺癥、腦出血后遺癥、腦動(dòng)脈硬化癥等誘發(fā)的各種癥狀［1］。其主藥以長(zhǎng)春胺為起始原料，經(jīng)脫水消除、水解和酯化制得。在長(zhǎng)春西汀中間體制備過(guò)程中使用了對(duì)甲苯磺酸作催化劑，后續(xù)處理過(guò)程中雖進(jìn)行了充分洗滌，但仍可能存在對(duì)甲苯磺酸殘留，在后續(xù)的酯化反應(yīng)中會(huì)繼續(xù)反應(yīng)，生成基因毒性雜質(zhì)對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯，故需在成品的質(zhì)量控制中嚴(yán)格控制后兩者含量。目前，對(duì)甲苯磺酸酯類的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜（HPLC）法［2-8］、液質(zhì)聯(lián)用法［9-12］、氣質(zhì)聯(lián)用法［13-15］等。HPLC法具有成本低、分離快、靈敏度高、適用于熱不穩(wěn)定化合物等優(yōu)點(diǎn)。本研究中建立了測(cè)定長(zhǎng)春西汀注射液中對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯含量的HPLC法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀，含2998二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；XPE-105型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ2200E型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)甲苯磺酸甲酯對(duì)照品（批號(hào)為F1012054，含量為98.0%），對(duì)甲苯磺酸乙酯對(duì)照品（批號(hào)為E1012037，含量為98.0%），均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；長(zhǎng)春西汀注射液（7個(gè)廠家，共79批，包括2mL∶10mg，5 mL∶30 mg，2 mL∶20 mg 3種規(guī)格）；磷酸為分析純，乙腈為色譜純，水為高純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：WatersODS2C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（39∶61，V／V）；流速：1.0mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：226nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：取對(duì)甲苯磺酸甲酯對(duì)照品和對(duì)甲苯磺酸乙酯對(duì)照品各適量，精密稱定，用流動(dòng)相溶解，并制成兩者質(zhì)量濃度均約為0.25μg／mL的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取2 mL∶20 mg規(guī)格樣品3支，混勻，精密量取5 mL，置10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋并定容，搖勻，即得；其余規(guī)格樣品，直接取樣品溶液進(jìn)樣。

陰性對(duì)照品溶液：根據(jù)各廠家提供的長(zhǎng)春西汀注射液處方，取山梨醇、苯甲醇、維生素C、焦亞硫酸鈉、酒石酸等輔料適量，用流動(dòng)相溶解并濾過(guò)，取濾液，即得。

空白溶液：取流動(dòng)相，作為空白溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下除供試品溶液外的3種溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，理論板數(shù)以對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯峰計(jì)分別為13 359和13 880，分離度為9.2，空白溶液和陰性對(duì)照品溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1。

圖1 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the specific test

線性關(guān)系考察：取對(duì)甲苯磺酸甲酯12.24 mg和對(duì)甲苯磺酸乙酯9.27 mg，精密稱定，置同一100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解，并定容，搖勻。精密量取2.5 mL，置100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，作為線性試驗(yàn)混合對(duì)照品貯備液。精密量取1，1.5，2，3，4 mL，分別置20 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容，搖勻，即得線性混合對(duì)照品溶液。精密量取20μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得回歸方程，對(duì)甲苯磺酸甲酯為Y1＝63 593.589 2X1-309.226 0（r1＝0.999 9，n＝5），對(duì)甲苯磺酸乙酯為Y2＝61 195.719 7 X2-317.174 5（r2＝0.999 8，n＝5）。結(jié)果表明，對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯質(zhì)量濃度分別在0.149 9～0.599 8μg／mL和0.1136～0.4542μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

回收率試驗(yàn)和加標(biāo)重復(fù)性試驗(yàn)：考慮到各廠家間工藝、處方的差異，取長(zhǎng)春西汀注射液使用輔料最多的G公司生產(chǎn)批號(hào)為1901261的樣品10支（規(guī)格為2 mL∶20 mg，均未檢出對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯），混勻，精密量取2 mL，共6份，分別精密加入一定量的對(duì)照品溶液2 mL，搖勻。精密量取20μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0901分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中回收率相關(guān)要求，待測(cè)成分含量在0.1%時(shí)，回收率限度為90%～108%。本方法試驗(yàn)中對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯的回收率分別為98.78%和99.33%，表明準(zhǔn)確度符合要求。6份加標(biāo)樣品中對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯含量的RSD均小于3.0%，表明方法的重復(fù)性符合要求。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n＝6）

定量限和檢測(cè)限確定：取線性混合對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，得對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯的定量限（信噪比＞10時(shí)）分別為0.037μg／mL和0.045μg／mL，檢測(cè)限（信噪比＞3時(shí)）分別為0.015μg／mL和0.023μg／mL。

精密度試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯峰面積的RSD分別為0.92%和1.96%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液，于室溫放置0，1，2，3，4，5，6，7，8h時(shí)分別按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯峰面積有變小的趨勢(shì)，RSD分別為4.00%和4.20%（n＝9），建議供試品溶液在配制后6h內(nèi)測(cè)定（此時(shí)的RSD均小于2.0%）。

2.4 樣品測(cè)定

分別取7個(gè)廠家各1批樣品（A公司，批號(hào)為191108；B公司，批號(hào)為P1／20190901；C公司，批號(hào)為A92055A；D公司，批號(hào)為11904042；E公司，批號(hào)為1902211；F公司，批號(hào)為1906181；G公司，批號(hào)為1901241），按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖2。按外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果均未檢出對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯。

3 討論

3.1 流動(dòng)相優(yōu)化

圖2 7批樣品高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of seven batches of samples

預(yù)試驗(yàn)中先后考察了3種流動(dòng)相：①乙腈-0.1%磷酸溶液（39∶61，V／V），檢測(cè)波長(zhǎng)為226 nm；②乙腈-水（40∶60，V／V），檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；③乙腈-0.2 mol／L醋酸銨溶液（50∶50，V／V），檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種流動(dòng)相均可滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求，但流動(dòng)相③的檢測(cè)限比流動(dòng)相①和流動(dòng)相②約高10倍，流動(dòng)相②的系統(tǒng)耐用性較差，故選擇流動(dòng)相①。

3.2 色譜柱選擇

預(yù)試驗(yàn)中先后考察了3種色譜柱：①Waters ODS2 C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；②Agilent TC-C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；③ACEExcel C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，3種色譜柱均可滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求，但選擇色譜柱②和色譜柱③時(shí)，2種待測(cè)物出峰時(shí)間均晚于長(zhǎng)春西汀主成分，由于供試品溶液濃度較大，有拖尾現(xiàn)象，導(dǎo)致2種待測(cè)組分的靈敏度低，達(dá)不到限度要求。選擇色譜柱①時(shí)，2個(gè)待測(cè)組分在長(zhǎng)春西汀主峰前流出，可杜絕高濃度樣品對(duì)待測(cè)組分的干擾，降低基線噪音，提高檢測(cè)的靈敏度。故選擇色譜柱①。

3.3 待測(cè)物確認(rèn)

試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，供試品溶液色譜圖中，在待測(cè)物保留時(shí)間附近還有其他色譜峰，為排除因保留時(shí)間漂移引起的漏檢，對(duì)上述樣品均進(jìn)行加標(biāo)回收驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果表明，該色譜峰不是待測(cè)物，應(yīng)為長(zhǎng)春西汀原料引入的其他雜質(zhì)。

3.4 限度確定

根據(jù)人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）的規(guī)定，基因毒性雜質(zhì)的最大攝取量為1.5μg／d［16-17］，長(zhǎng)春西汀每天最大用量為30 mg，按此計(jì)算，確定對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯的限度不得超過(guò)0.005%。

3.5 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的HPLC法可快速、準(zhǔn)確地對(duì)注射用長(zhǎng)春西汀中對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯進(jìn)行定性及定量分析，避免使用液質(zhì)儀、氣質(zhì)儀等貴重和普及度較低的儀器，降低了檢驗(yàn)成本，提高了方法的可行性，可為該藥中潛在的有害雜質(zhì)的檢測(cè)提供參考。