劉小雨，楊海波，張 倩，趙 語△

（1.重慶醫(yī)科大學附屬大學城醫(yī)院藥學部，重慶 401331； 2.中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院藥學部，重慶 400037）

腎細胞癌是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢［1］，根據(jù)病理類型分為腎透明細胞癌（KIRC）、腎乳頭狀細胞癌（KIRP）、腎嫌色細胞癌（KICH）等，其中KIRC是最常見的病理亞型，約占75%［2］。早期KIRC主要通過手術(shù)治療，晚期及轉(zhuǎn)移性KIRC主要采用靶向治療，但以上方法在延緩腫瘤進展、提高生存率等方面作用仍有限［3］。近年來，靶向程序性死亡受體1（PD-1）／程序性死亡配體1（PD-L1）、細胞毒性T細胞相關(guān)抗原-4（CTLA4）的免疫療法已用于KIRC的治療，但僅部分患者能從中獲益。KIRC中存在高水平巨噬細胞、淋巴細胞等免疫細胞的浸潤，且免疫細胞的浸潤水平對KIRC患者的預后有重要調(diào)控作用［4-5］。因此，腫瘤免疫浸潤水平影響腫瘤患者的預后［6］。研究KIRC浸潤相關(guān)免疫基因并篩選免疫浸潤標記物，對于改善KIRC的預后有重要意義。G蛋白偶聯(lián)受體信號通路參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［7］，G蛋白信號調(diào)節(jié)因子3（GPSM3）是G蛋白偶聯(lián)受體信號調(diào)節(jié)因子［8］，可促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［9］，但GPSM3在KIRC中的具體作用尚不清楚。本研究中利用多種生物信息學數(shù)據(jù)庫研究GPSM3在KIRC中的表達情況及與預后的相關(guān)性，以及對腫瘤免疫浸潤的影響，尋找KIRC潛在判斷預后的標記物?，F(xiàn)報道如下。

1 數(shù)據(jù)庫選擇與分析方法

1.1 GPSM3在不同類型腫瘤組織中的差異表達分析

腫瘤免疫評估（TIMER）數(shù)據(jù)庫（https：／／cistrome.shinyapps.io／timer／）是綜合分析多種腫瘤與免疫細胞浸潤水平相關(guān)性的數(shù)據(jù)庫，可用于分析GPSM3在不同類型腫瘤組織中的表達?；虮磉_譜交互分析（GEPIA）數(shù)據(jù)庫（http：／／gepia.cancer-pku.cn／）屬腫瘤綜合分析數(shù)據(jù)庫，可用于進一步分析GPSM3在腫瘤和癌旁組織中的差異表達。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.2 GPSM3表達水平與腫瘤患者預后的相關(guān)性分析

癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)挖掘網(wǎng)站（UALCAN，http：／／ualcan.path.uab.edu／analysis.html）屬腫瘤在線分析數(shù)據(jù)庫?？衫肬ALCAN分析GPSM3的表達與腫瘤患者生存率的相關(guān)性，通過TIMER數(shù)據(jù)庫進一步分析GPSM3的表達與腫瘤患者累計生存率的相關(guān)性。進行Spearman等級相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，1.3，1.5，1.6項同。

1.3 GPSM 3與腫瘤病理分期的相關(guān)性分析

利用GEPIA數(shù)據(jù)平臺提供的“Pathological Stage Plot”在線分析GPSM3表達水平與腫瘤病理分期的關(guān)系。

1.4 GPSM 3主要生物學功能分析

利用3.0版GSEA富集分析軟件分析，從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載KIRC腫瘤組織樣本的RNA-seq數(shù)據(jù)（n＝538）。根據(jù)GPSM3表達水平的中位數(shù)將其分為高表達組和低表達組，結(jié)合MsigDB數(shù)據(jù)庫中的c5.bp.v6.2.symbols.gmt功能基因集對高表達組進行功能富集分析。以歸一化富集得分（NES）≥1.0、錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）≤0.25、P＜0.05的基因集作為有意義的基因集合。

1.5 GPSM3與腫瘤免疫細胞浸潤水平的相關(guān)性分析

利用TIMER數(shù)據(jù)庫“gene”模塊分析GPSM3的表達與B細胞、CD4＋T細胞、CD8＋T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等6種腫瘤免疫細胞浸潤水平的相關(guān)性。通過“Scan”模塊分析GPSM3基因拷貝數(shù)的改變對以上6種免疫細胞浸潤水平的影響。GPSM3基因拷貝數(shù)的改變分為“arm-level deletion”“diploid／normal”“arm-level gain”3個級別。

1.6 GPSM 3與免疫調(diào)節(jié)劑及趨化因子的相關(guān)性

TISIDB（http：／／cis.hku.hk／TISIDB／index.php）是一個包含30種癌癥類型的綜合分析腫瘤與免疫系統(tǒng)相互作用的數(shù)據(jù)庫。本研究中用其分析GPSM3與免疫調(diào)節(jié)劑（免疫增強劑和免疫抑制劑）及趨化因子的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 GPSM 3在腫瘤組織中的表達情況

圖1 GPSM3在腫瘤組織與癌旁正常組織中的表達情況Fig.1 The expression of GPSM 3 in tumor tissues and adjacent normal tissues

與相應(yīng)癌旁正常組織比較，GPSM3在KIRC、乳腺浸潤癌（BRCA）、膽管癌（CHOL）、食管癌（ESCA）、頭頸鱗狀細胞癌（HNSC）、KIRP及前列腺癌（PRAD）中的表達水平顯著升高，在結(jié)腸癌（COAD）、KICH、肺腺癌（LUAD）及肺鱗癌（LUSC）中的表達水平顯著降低（P＜0.01），詳見圖1 A。與相應(yīng)癌旁正常組織比較，GPSM3在CHOL及KIRC中呈顯著高表達，在LUSC中呈顯著低表達（P＜0.05），在其余8種腫瘤組織中的表達差異不顯著（P＞0.05），詳見圖1 B。

2.2 GPSM 3表達水平與腫瘤患者預后的關(guān)系

GPSM3的高表達顯著降低KIRC患者的生存率（P＜0.05），GPSM3的差異表達對CHOL及LUSC患者生存率無明顯影響（P＞0.05），詳見圖2 A。且TIMER數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果與UALCAN數(shù)據(jù)庫一致，詳見圖2 B。因此，GPSM3的高表達是KIRC患者預后不良的預測指標。

2.3 GPSM 3表達水平與KIRC病理分期的關(guān)系

一般情況下，腫瘤病理分期越高，患者預后越差。本研究結(jié)果顯示，KIRC的病理分期越高，GPSM3的表達水平越高（P＜0.05），詳見圖3。

2.4 GPSM 3功能富集分析

GPSM3高表達組的樣本主要富集于適應(yīng)性免疫、白細胞介導的免疫、白細胞的增殖與活化、T細胞的增殖與活化等免疫相關(guān)通路，詳見表1。因此，高表達GPSM3或在KIRC腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮了重要作用。

2.5 GPSM 3的表達與腫瘤免疫浸潤水平的關(guān)系

腫瘤免疫浸潤是腫瘤進展的關(guān)鍵因素，顯著影響腫瘤患者的生存率［5］。GPSM3的表達水平對數(shù)值與KIRC腫瘤純度呈負相關(guān)（cor＝-0.381），與腫瘤組織中B細胞［偏相關(guān)系數(shù)（partial cor）＝0.38］、CD8＋T細胞（partial cor＝0.549）、CD4＋T細胞（partial cor＝0.512）、巨噬細胞（partial cor＝0.483）、中性粒細胞（partial cor＝0.653）及樹突狀細胞（partial cor＝0.678）的浸潤水平呈正相關(guān)（P＜0.05），詳見圖4 A。GPSM3基因拷貝數(shù)的變化與腫瘤免疫細胞浸潤水平的降低相關(guān)（P＜0.05），詳見圖4B。以上結(jié)果提示，GPSM3的表達水平對數(shù)值與腫瘤免疫細胞浸潤水平呈正相關(guān)。

圖2 GPSM3表達水平與腫瘤患者預后的關(guān)系Fig.2 The correlation between the expression of GPSM 3 and the prognosis of tumor patients

圖3 GPSM3表達水平與KIRC病理分期關(guān)系的小提琴圖Fig.3 Violin diagram of the correlation between GPSM3 expression and KIRC pathological stage

2.6 GPSM3表達水平與免疫調(diào)節(jié)劑及趨化因子的關(guān)系

免疫調(diào)節(jié)劑如免疫抑制劑、免疫增強劑等是調(diào)控免疫系統(tǒng)的重要功能物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子在調(diào)控腫瘤免疫浸潤中發(fā)揮了重要作用［10］。TISIDB分析結(jié)果見表2，可見，表中部分因子包括，可誘導共刺激分子（ICOS），殺傷細胞凝集素樣受體K1（KLRK1）、淋巴毒素-α（LTA）、組織相容性復合物Ⅰ類相關(guān)基因B（MICB）、腫瘤壞死因子受體超家族成員18（TNFRSF18）、集落刺激因子1受體（CSF1R）、CTLA-4、淋巴細胞激活基因3（LAG3）、半乳糖凝集素9（LGALS9）、PD-1、T細胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白（TIGIT）。

表1 GPSM3功能富集分析Tab.1 Enrichment analysis of GPSM 3 function

圖4 GPSM 3與腫瘤免疫細胞浸潤水平的相關(guān)性Fig.4 The correlation between GPSM3 and tumor immune cell infiltration level

表2 TISIDB數(shù)據(jù)庫對GPSM3與免疫調(diào)節(jié)劑及趨化因子的相關(guān)性分析Tab.2 The correlation between GPSM3 and immune modulators／chemokines in TISIDB database

3 討論

KIRC的發(fā)病率和死亡率不斷升高。近年來，以靶向免疫檢查點為核心的免疫療法為KIRC的治療帶來了希望，但大部分患者仍表現(xiàn)出耐受。腫瘤中免疫細胞浸潤水平顯著影響患者的臨床結(jié)局，故浸潤進腫瘤的免疫細胞被認為是潛在的藥物治療靶點。因此，需研究KIRC浸潤相關(guān)免疫基因并篩選免疫浸潤標記物。

GPSM3是G蛋白耦聯(lián)受體調(diào)節(jié)因子［7］，目前關(guān)于其在腫瘤中的作用相關(guān)研究較少。本研究中分析了GPSM3在KIRC中的表達水平及對預后的影響，結(jié)果與癌旁組織相比，GPSM3在KIRC中呈高表達且與患者預后不良呈正相關(guān)。且KIRC，KIRP，KICH是RCC的3種病理亞型，與癌旁組織相比，GPSM3僅在KIRC中高表達，說明通過GPSM3表達水平的高低還可初步判斷RCC亞型，協(xié)助臨床做出診斷。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）屬炎性小體，可抑制腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移及誘導凋亡，且NLRP3在KIRC腫瘤組織中呈低表達［11-12］。另有研究發(fā)現(xiàn)，GPSM3可抑制NLRP3的活性，提示過表達GPSM3可能通過抑制NLRP3促進KIRC細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，從而抑制腫瘤細胞的凋亡［13］。腫瘤血管的生成可促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，有研究模擬腫瘤微環(huán)境中血管的生成，發(fā)現(xiàn)GPSM3在其中的表達增加了2倍以上，說明GPSM3介導了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［14］。但關(guān)于GPSM3在抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)中的作用尚不清楚。

腫瘤中浸潤的免疫細胞可調(diào)控腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［10］，故進一步探索新的免疫調(diào)節(jié)劑有助于了解腫瘤與免疫微環(huán)境的相互作用。本研究中，GPSM3在調(diào)控KIRC腫瘤免疫浸潤中發(fā)揮重要作用。首先，基因富集分析（GSEA）功能富集分析顯示，GPSM3高表達參與白細胞及T細胞的增殖與活化。其次，GPSM3可促進腫瘤免疫細胞如中性粒細胞和樹突狀細胞的浸潤。且GPSM3與多種免疫抑制劑、免疫增強劑及趨化因子呈顯著正相關(guān)。有研究指出，中性粒細胞可在有差異的腫瘤微環(huán)境下促進腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移［15］。有研究發(fā)現(xiàn)，KIRC中中性粒細胞的浸潤促進了腫瘤細胞的增殖［16］。另外，樹突狀細胞也在腫瘤免疫過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，不僅能誘導抗腫瘤免疫反應(yīng)，還可誘導免疫耐受［17］。樹突狀細胞可誘導調(diào)節(jié)性T細胞的增殖［18］，而調(diào)節(jié)性T細胞在維持自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用［19］。此外，趨化因子受體表達于多種免疫細胞，且趨化因子可調(diào)控免疫細胞向腫瘤微環(huán)境中募集［10］。有研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子可促進中性粒細胞及樹突狀細胞向腫瘤部位募集［10，20］。以上研究結(jié)果提示，高表達GPSM3可能通過提高中性粒細胞和樹突狀細胞的浸潤水平而降低KIRC患者的生存率。此外，靶向PD-1／PD-L1及CTLA4的免疫療法對KIRC治療響應(yīng)性低，故改善腫瘤對免疫療法的反應(yīng)是關(guān)鍵途徑。本研究中，GPSM3與免疫調(diào)節(jié)劑PDCD1及CTLA4呈顯著正相關(guān)，提示靶向給予GPSM3可能為提高免疫療法的療效提供了新策略。故進一步探討GPSM3調(diào)控腫瘤免疫浸潤的具體作用機制具有重要意義。

綜上所述，GPSM3在KIRC中高表達且與患者預后不良呈正相關(guān)，GPSM3表達水平與腫瘤免疫浸潤水平呈顯著正相關(guān)。本研究中揭示了GPSM3在調(diào)節(jié)KIRC免疫中新的潛在功能，其有望成為KIRC的預后生物標記物。