楊 錦，王雯，梁馨月，薛佩蕓，陳 萍，△

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046； 2.兵器工業(yè)衛(wèi)生研究所，陜西 西安 710065； 3.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

地黃又名地髓、芐、芑［1］，為玄參科多年生草本植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并被列為上品，是傳統(tǒng)的四大懷藥之一，也是我國傳統(tǒng)大宗中藥材。生地黃味甘，性寒，歸心、肝、腎經(jīng)，為清熱涼血之品，有清熱涼血、養(yǎng)陰生津功效，用于熱入營血、溫毒發(fā)斑、吐血等證［2］。其臨床主要用于心腦血管疾?。?］、糖尿病及其并發(fā)癥、骨質(zhì)疏松等疾病的治療，并可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［4］。生地黃主要含有苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、糖類、紫羅蘭酮類等化合物［5］。目前對(duì)其研究主要集中在飲片及其顆粒的質(zhì)量控制、化學(xué)成分、藥理學(xué)等方面［6］，而對(duì)生地黃配方顆粒工藝優(yōu)化及其化學(xué)成分的量值傳遞研究尚未見報(bào)道。本研究中采用正交試驗(yàn)法，以出膏率、總多糖及苯乙醇苷類4個(gè)成分含量綜合值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選生地黃標(biāo)準(zhǔn)煎劑的最佳提取工藝；飲片經(jīng)最佳工藝提取，制備成配方顆粒，通過特征成分的含量測定，考察飲片、中間體和配方顆粒間量值傳遞效果?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CP2102型電子天平（奧豪斯儀器＜常州＞有限公司，精度為0.01 g）；SQP型電子天平（規(guī)格為QUINTIX224-1CN、精 度 為0.1 mg，規(guī) 格 為SECURA125-1CN、精度為0.01 mg），均購自賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；CS101-3EB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（重慶四達(dá)試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；ZF-C型三用紫外分析儀（上?？岛坦怆妰x器有限公司）；Mb型可調(diào)式電熱板（北京科偉永興儀器有限公司）；ZDHW型調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司，規(guī)格為3 000 mL）；GZL100-25L型濕法制粒機(jī)（石家莊科源機(jī)械設(shè)備有限公司，功率為7.5 kW）；Synergy型超純水制水機(jī)（默瑞＜上海＞生物科技有限公司）。

1.2 試藥

生地黃配方顆粒3批（楊凌生物醫(yī)藥科技股份有限公司，編號(hào)分別為01，02，03，批號(hào)分別為20200701，20200702，20200703）；毛 蕊 花 糖 苷 對(duì) 照 品（批 號(hào) 為1530-200202，規(guī)格為20 mg，含量＞98%），D-無水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)為110833-201908，含量＞99.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；焦地黃苯乙醇苷A1（批號(hào)為P16M11S109726，規(guī)格為10 mg，含量＞95%），焦地黃苯乙醇苷B1（批號(hào)為P16M11S109727，規(guī)格為20 mg，含 量＞97%），異 毛 蕊 花 糖 苷（批 號(hào) 為W17J10C90785，規(guī)格為20 mg，含量＞98%），洋地黃葉苷C（批號(hào)為P14M11F109729，規(guī)格為5 mg，含量＞95%），均購于上海源葉生物科技有限公司；乙腈、磷酸均為色譜純，甲醇為分析純，水為自制超純水；生地黃飲片3批（陜西興盛德中藥飲片有限公司，批號(hào)分別為20190101，20190301，20200101），經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所炮制鑒定室楊智峰研究員顯微鑒別均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分考察

2.1.1 干膏率

分別精密量取煎煮液20 mL，分別置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)?05℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏率。

2.1.2 總多糖含量

溶液制備：稱取105℃下干燥至恒重的D-無水葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成質(zhì)量濃度為1.737 2 mg／mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。精密量取煎煮液各2.0 mL，分別加入8.0 mL無水乙醇，渦旋混勻，放置過夜，離心，傾出上清液，沉淀，用10 mL 80%乙醇洗滌2次，用水溶解，并定容至10mL，即得供試品溶液。

線性關(guān)系考察：分別精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.2，1.6，2.0，3.0 mL，置50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，制成系列對(duì)照品溶液，各精密量取3.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加入5%苯酚溶液1.0 mL，渦旋混勻，迅速滴加濃硫酸6.0 mL，渦旋混勻，于50℃水浴放置40 min，取出，置水中冷卻至室溫，混勻，制成質(zhì)量濃度分別為0，2.084 6，4.169 3，6.253 9，8.338 5，12.507 8，16.677 1，20.846 4，31.269 6μg／mL的系列待測溶液，按分光光度法（2020年版《中國藥典（一部）》附錄ⅤA），于490 nm波長處測定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝0.045 8 X-0.021 2，R2＝0.998 8（n＝9）。結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在2.084 6～31.269 6μg／mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

吸光度測定：精密量取上述供試品溶液各1.0 mL，加水2.0 mL，同線性關(guān)系考察項(xiàng)下方法自“加入5%苯酚溶液1.0 mL”起操作，依法測定吸光度，并計(jì)算。

2.1.3 苯乙醇苷類成分含量

色譜條件：色譜柱為Diamonsil Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時(shí)10%A→14%A，10～32 min時(shí)14%A→20%A，32～35 min時(shí)20%A→10%A，35～37 min時(shí)10%A）；流速為1.0 mL／min；檢測波長為334 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10μL。

溶液制備：分別取焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1和異毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加乙腈-0.1%磷酸溶液（16∶84，V／V），制成每1 mL分別含焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1和異毛蕊花糖苷22.80，34.82，59.36，45.36μg的混合對(duì)照品溶液。精密吸取煎煮液各5 mL，置25 mL容量瓶中，分別加甲醇15 mL，超聲10 min，用甲醇定容，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)靡译?0.1%磷酸溶液（16∶84，V／V）溶解，移至5 mL容量瓶中，用乙腈-0.1%磷酸溶液（16∶84，V／V）定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。精密吸取5 mL水，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1和異毛蕊花糖苷的保留時(shí)間分別為20.935，27.399，29.425，31.183 min，理論板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1.5，拖尾因子為1.16～1.23，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系與檢測限、定量限考察：分別精密量取混合對(duì)照品溶液0.2，0.5，0.8，1.0，1.5，2.0 mL，置2 mL容量瓶中，用乙腈-0.1%磷酸溶液（16∶84，V／V）定容，搖勻，分別精密吸取10μL，按2.1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以各成分質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，以信噪比（S／N）為3和10時(shí)的質(zhì)量濃度分別作為檢測限和定量限，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系與檢測限、定量限考察結(jié)果（n＝6）Tab.1 Linear relationship and the results of LOD and LOQ（n＝6）

精密度試驗(yàn)：分別精密吸取對(duì)照品溶液10μL，按2.1.3項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，并連續(xù)測定6 d。結(jié)果焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、異毛蕊花糖苷日內(nèi)、日間峰面積的RSD分別為0.45%，0.45%，0.25%，0.13%（n＝6）和0.29%，0.33%，0.27%，0.45%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液10μL，室溫下按2.1.3項(xiàng)下色譜條件分別于0，2，4，8，12，16，24 h時(shí)進(jìn)樣測定。結(jié)果焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1和異毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.29%，2.37%，3.66%，2.37%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取煎煮液5 mL，共6份，依法制備供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1和異毛蕊花糖苷的平均含量分別為129.08，283.68，67.82，78.27μg／mL，RSD分別為4.46%，4.03%，4.84%，4.17%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的煎煮液2.0 mL，共9份，分為3組，置25 mL容量瓶中，分別精密加入焦地黃苯乙醇苷A1對(duì)照品溶液（237.5μg／mL）0.5，1.0，1.6 mL，毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液（489.6μg／mL）0.6，1.2，1.8 mL，焦地黃苯乙醇苷B1對(duì)照品溶液（148.4μg／mL）0.4，0.9，1.4 mL，異毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液（113.4μg／mL）0.7，1.4，2.0 mL，加甲醇15 mL，超聲10min，用甲醇定容，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10mL，蒸干，殘?jiān)靡译?0.1%磷酸溶液（16∶84，V／V）溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，用乙腈-0.1%磷酸溶液（16∶84，V／V）定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按2.1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

2.2 吸水率考察

稱取藥材樣品（批號(hào)為20200101）50.0 g，共3份，依次加水600 mL，攪勻，浸泡，分別于20，40，60，80，100 min及2，12，13 h時(shí)濾出藥液，讀取體積，直至體積不再減少。結(jié)果表明，藥液體積12 h后不再增加，計(jì)算吸水率為185.9%，故首次加水量不得低于10倍量。

2.3 正交試驗(yàn)與結(jié)果［7-9］

因素水平：影響樣品水煎煮的主要因素有浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、加水量（倍數(shù)）、煎煮次數(shù)及粒度，考慮大生產(chǎn)常以飲片投料，在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇浸泡時(shí)間（A）、煎煮時(shí)間（B）、加水量（C）、煎煮次數(shù)（D）作為考察因素，以干膏率、總多糖及苯乙醇苷類4個(gè)成分含量綜合值為考察指標(biāo)，因素水平見表3。

正交試驗(yàn)及方差分析：結(jié)果見表4、表5。可見，各因素作用強(qiáng)弱依次為D＞A＞C＞B；因素A和因素D對(duì)結(jié)果有顯著影響。根據(jù)大生產(chǎn)實(shí)際情況綜合考慮，確定最佳提取工藝為A3B2C2D3，即浸泡1.5 h，分別加10，8，6倍量水，3次分別煎煮2.0，1.5，1.0 h。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab.2 Results of the recovery tests（n＝9）

表3 因素水平表Tab.3 The factors and levels

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.4 Design and results of the orthogonal test

驗(yàn)證試驗(yàn)：取藥材樣品（批號(hào)為20200101）50.0 g，共3份，按最佳工藝進(jìn)行煎煮、濃縮，稀釋至1 000 mL，制備成供試品溶液。結(jié)果供試品溶液中生地黃總多糖、焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、異毛蕊花糖苷含量及干膏率均大于或接近正交試驗(yàn)表中的最高值，且重復(fù)性好，工藝相對(duì)穩(wěn)定、合理。詳見表6。

表5 方差分析結(jié)果Tab.5 Results of ANOVA

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.6 Results of the verification test（n＝3）

2.4 成型工藝研究

采用減壓濃縮方法，生地黃提取物以60℃減壓（-0.09 MPa）條件濃縮至相對(duì)密度為1.10～1.20（60℃）的溶液，以糊精作為輔料，以浸膏與糊精（2.5∶1，m／m）混合，乙醇制粒，干燥，即得配方顆粒。

配方顆粒最佳制備工藝：取藥材2.0 kg，以水浸泡2 h，分別加10，8，6倍量水，分別煎煮2.0，1.5，1.0 h，濾過，合并濾液，濃縮至相對(duì)密度為1.20～1.30（60℃）的稠膏，加適量糊精，浸膏與糊精（2.5∶1，m／m）混合，以乙醇為黏合劑制粒，干燥，即得配方顆粒1.0 kg。

2.5 中試試驗(yàn)［7］

取3批藥材樣品各20.0 kg，以2.4項(xiàng)下工藝制備，得3批配方顆粒，進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果見表7。

表7 中試試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.7 Results of the Pilot test（n＝3）

2.6 指標(biāo)成分量值傳遞［8-9］

對(duì)照品制備：分別精密量取2.1.3項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.0 mL，置2 mL容量瓶中，用乙腈-0.1%磷酸溶液（16∶84，V／V）定容，制成每1 mL分別含焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1和異毛蕊花糖苷11.400，17.408，29.680，22.680μg的混合對(duì)照品溶液1。

供試品制備：稱取3批藥材飲片樣品粗粉各約0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取1.5 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，減壓回收溶劑近干，殘?jiān)靡译?0.1%磷酸溶液（16∶84，V／V）溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，用乙腈-0.1%磷酸溶液（16∶84，V／V）定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得飲片供試品溶液；分別取中間體、配方顆粒適量，各3批，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱定，同飲片供試品溶液方法制備，即得中間體供試品溶液和配方顆粒供試品溶液。

含量測定：取混合對(duì)照品溶液1和上述3種供試品溶液適量，按2.1.3色譜條件進(jìn)樣，測定焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1和異毛蕊花糖苷的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見表8。

表8 飲片→中間體→配方顆粒的苯乙醇苷類成分量值傳遞結(jié)果（%）Tab.8 Quantity transfer results of phenylethanoid glycosides from decoction pieces→intermediates→formula granules（%）

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

預(yù)試驗(yàn)中比較了乙腈-0.1%醋酸溶液和乙腈-0.1%磷酸溶液作流動(dòng)相時(shí)對(duì)結(jié)果的影響，測定苯乙醇苷類含量時(shí)，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)基線更平穩(wěn)，特征成分分離效果更好。故優(yōu)選乙腈-0.1%磷酸溶液作為洗脫體系，并優(yōu)化得到最佳洗脫程序。

3.2 成分量值轉(zhuǎn)化分析

生地黃飲片、正交煎煮液、中間體、配方顆粒中均檢測到洋地黃葉苷C成分，其保留時(shí)間為16.035 min，分離度較好，由于對(duì)照品量少且不穩(wěn)定，配制的溶液保存時(shí)間短，不易進(jìn)行含量測定，故只作成分指認(rèn)；中藥在煎煮和制劑工藝過程中可能產(chǎn)生新物質(zhì)或發(fā)生其他動(dòng)態(tài)變化，是中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究中的重要因素。本試驗(yàn)中，生地黃中間體和配方顆粒中的毛蕊花糖苷轉(zhuǎn)移率偏低，異毛蕊花糖苷轉(zhuǎn)移率偏高，由于毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷為同分異構(gòu)體，生地黃在煎煮過程中毛蕊花糖苷可能部分轉(zhuǎn)化為異毛蕊花糖苷［10-12］，將焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1和異毛蕊花糖苷4個(gè)成分含量綜合值作為評(píng)價(jià)生地黃的量值傳遞研究的特征成分更合理。

3.3 輔料選擇

采用優(yōu)選的最佳提取工藝進(jìn)行生地黃特征成分的提取，能提高制劑含藥量，利于飲片發(fā)揮藥效；生地黃飲片中特征成分的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，采用60℃減壓（-0.09 MPa）濃縮至相對(duì)密度為1.20～1.30（60℃）；由于中藥浸膏多具有吸濕性，故選擇加入適當(dāng)、適量的輔料與之混合，輔料選用糊精、淀粉進(jìn)行考察，其中糊精具有無異味、溶解性好、不易吸潮、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可溶性淀粉具有成型性好、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且吸附力強(qiáng)、流動(dòng)性好等優(yōu)點(diǎn)［13-14］。本研究結(jié)果顯示，糊精比淀粉流動(dòng)性、成型性好，不易吸濕，故選擇糊精作為輔料。又考察了潤濕劑為乙醇溶液時(shí)，浸膏與糊精的比例分別為3∶1（m／m）和2.5∶1（m／m）時(shí)的生地黃配方顆粒質(zhì)量，結(jié)果確定浸膏與糊精的比例為2.5∶1（m／m）時(shí)生地黃配方顆粒質(zhì)量最佳。

傳統(tǒng)的中藥煎劑制備成中藥配方顆粒后，由于劑型發(fā)生改變，可能影響特征成分的量值傳遞。在制備工藝過程中，綜合考慮苯乙醇苷類4個(gè)成分的總體含量、總干膏率均穩(wěn)定，轉(zhuǎn)移率高，生地黃飲片-中間體-配方顆粒間特征成分的量值轉(zhuǎn)化過程較好地保留了原飲片成分，一致性較好，本研究為配方顆粒替代傳統(tǒng)煎劑的研究提供了思路。