李 月，周 永，張蕓綺，王妙然，藺曉菁，鐘 瑩，李繼斌

（1.重慶醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室，重慶 400016； 2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院重大代謝性疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室，重慶 400016； 3.重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，重慶 401320）

乳腺癌為常見惡性腫瘤，2018年乳腺癌發(fā)生率位居全球惡性腫瘤第2，病死率第5［1］。目前，乳腺癌的臨床治療措施主要有手術(shù)切除、放射治療（簡稱放療）、化學治療（簡稱化療）和分子靶向治療。隨著早期診斷和治療策略的改進，患者預(yù)后明顯改善，但仍有較多患者最終出現(xiàn)腫瘤復發(fā)和耐受現(xiàn)象。蛇葡萄素（AMP）又名二氫楊梅素（DMY），屬黃酮類化合物。植物化學研究表明，DMY和楊梅素分別是藤茶中的2種主要黃酮類化合物。AMP（20%～30%，m／m）的含量遠高于楊梅素（1.5%～3.0%，m／m）［2］。AMP具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等生物學活性［3］。網(wǎng)絡(luò)藥理學以系統(tǒng)生物學為基礎(chǔ)，對“藥物-靶點-疾病”間關(guān)系進行分析，強調(diào)對信號通路的多調(diào)節(jié)途徑，與中藥“多成分-多靶點-多通路”的作用機制相似［4］。本研究中運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法預(yù)測AMP作用靶點及相關(guān)信號通路，并結(jié)合細胞試驗對潛在作用靶點進行驗證，闡釋AMP抗乳腺癌的作用機制。現(xiàn)報道如下。

1 靶點研究

1.1 靶點獲取

AMP靶點：通過Pubchem數(shù)據(jù)庫獲取AMP的3D分子結(jié)構(gòu)，保存為sdf格式，然后上傳至PharmMapper數(shù)據(jù)庫，得到AMP作用的靶點基因，根據(jù)fit score進行排序，利用UniProt數(shù)據(jù)庫的Retrieve／ID Mapping功能，將靶點的UniProt ID轉(zhuǎn)換為Gene Symbol。

疾病靶點：以“breast cancer”作為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫，并進行篩選，獲取疾病相關(guān)靶點數(shù)據(jù)集。使用R 4.0.4軟件，提取AMP與疾病靶點中的共同靶點，作為AMP治療乳腺癌的潛在作用靶點（即藥物-疾病共同靶點）。

1.2 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選

將上述過程獲得的靶點交集導入String蛋白質(zhì)分析平臺，蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，輸出結(jié)果格式為TSV格式。將文件中的node1和node2信息導入Cytoscape 3.2.1軟件中繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，利用“Tools”中的“Network Analysis”功能進行網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析，以大于或等于中位數(shù)1倍值的接近中心度和介數(shù)中心度，以及大于或等于中位數(shù)2倍值的度值為篩選標準。值越大表明節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的地位越重要，從而篩選出關(guān)鍵靶點。

1.3 關(guān)鍵靶點的生物過程與信號通路分析

將篩選出的關(guān)鍵靶點導入R 4.0.4軟件中建模，對關(guān)鍵靶點進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，探討AMP關(guān)鍵靶點的功能分布，預(yù)測AMP潛在的調(diào)控通路。

將上述過程獲得的靶點交集導入String蛋白質(zhì)分析平臺，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，輸出結(jié)果格式為TSV格式。將文件中的node1和node2信息導入Cytoscape 3.2.1中繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，利用“Tools”中的“Network Analysis”功能進行網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析，以大于或等于中位數(shù)1倍值的接近中心度和介數(shù)中心度及大于或等于中位數(shù)2倍值的度值為篩選標準；值越大表明節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的地位越重要。將PharmMapper數(shù)據(jù)庫AMP作用靶點與GeneCards得到的乳腺癌相關(guān)基因進行比對，篩選出119個AMP-乳腺癌潛在作用靶點。結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 蛇葡萄素抗乳腺癌靶點分析Fig.1 The anti-breast cancer targets of ampelopsin

圖2 蛇葡萄素抗乳腺癌PPI網(wǎng)絡(luò)分析Fig.2 Protein-protein interaction（PPI）network of ampelopsin against breast cancer

1.4 關(guān)鍵靶點的生物過程與信號通路分析

將篩選出的關(guān)鍵靶點導入R 4.0.4軟件中建模，對關(guān)鍵靶點進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，探討AMP關(guān)鍵靶點的功能分布，預(yù)測AMP潛在的調(diào)控通路。GO富集分析結(jié)果表明，這些靶點被富集到1 926個生物學過程，與response to oxidative stress，response to reactive oxygen species，cellular response to oxidative stress，regulation of MAPkinase activity，peptidyl-tyrosine phosphorylation 5個生物學過程密切相關(guān)；在細胞組分方面，靶點富集最多的是focal adhesion，cell-substrate adherens junction，cell-substrate junction；在分子功能中，主要起作用的是endopeptidase activity和protein serine／threonine kinase activity。結(jié)果見圖3 A（圖中BP為生物過程，CC為細胞組分，MF為分子功能）。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，與83個潛在靶點基因顯著相關(guān)（P≤0.05）的通路有63條，排名靠前的信號通路為：PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signalingpathway、Rassignalingpathway等，涉及基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）和非受體酪氨酸激酶（SRC）等。結(jié)果見圖3B。

2 細胞驗證試驗

2.1 儀器、試藥與細胞

儀器：3111型CO2培養(yǎng)箱、1510型酶標儀（美國ThermoFisher公司）；AX10型倒置熒光顯微鏡（德國Zeiss公司）；CFX96型實時定量聚合酶鏈反應(yīng)儀（美國Bio-Rad公司）。

試藥：AMP（成都曼斯特生物科技有限公司，批號為A0049，含量≥98%）；CCK-8檢測試劑盒（日本同仁公司）；Trizol總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；PRMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）均購自美國Gibco公司；Transwell小室（美國Coning公司）；PCR引物（生工生物工程＜上海＞股份有限公司）。

細胞：三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231（受贈于重慶醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院練雪梅教授）。

2.2 對MDA-MB-231細胞活力的影響

采用CCK-8法。于37℃及5%CO2條件下，培養(yǎng)MDA-MB-231細胞至對數(shù)生長期，調(diào)整細胞密度至每1 mL 1×104個，接種于96孔板中，每孔100μL。設(shè)定AMP濃度分別為0，20，40，60，80，100μmol／L，每組設(shè)5個復孔，作用24 h。培養(yǎng)結(jié)束后加入CCK-8，于450 nm波長處測定吸光度（A），計算細胞活力。細胞活力＝（A試驗-A空白）／（A對照-A空白）×100%，A試驗為具有細胞、CCK溶液和AMP溶液的吸光度，A空白為具有培養(yǎng)基和CCK溶液而無細胞的吸光度；A對照為具有細胞、CCK溶液而無AMP溶液的吸光度。結(jié)果，與0μmol／L比較，AMP濃度為20，40，60，80，100μmol／L時細胞活力顯著減弱，40μmol／L作用最明顯。結(jié)果見圖4。采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計學軟件分析，行Dunnett-t和獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義（下同）。

2.3 對MDA-MB-231細胞遷移的影響

采用劃痕試驗及Transwell試驗。將MDA-MB-231細胞接種于6孔板中，待細胞生長至80%～90%后，利用200μL槍頭進行垂直劃痕。磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗3次，加入一定濃度的AMP處理細胞24 h，分別在0 h和24 h時鏡下觀察并采集圖片。將MDA-MB-231細胞接種于6孔板中，加入20，40，60μmol／L的AMP處理細胞24 h后，將細胞接種于無基質(zhì)膠小室。上室加入不含血清的培養(yǎng)基（200μL），下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基（600μL）。24h后，細胞置4%多聚甲醛中固定15 min，PBS清洗細胞3次后，結(jié)晶紫染色液（0.05 mmol／L）染色20 min，在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果見圖5。

2.4 對MDA-MB-231細胞MMP2和SRC mRNA表達的影響

采用逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法。收集細胞，細胞按2×105個／孔的密度接種于6孔板中，以Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin引物為內(nèi)參。PCR條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性4 s，58℃退火10 s，65℃延伸5 s，共40個循環(huán)。以BioRad CFX軟件記錄擴增曲線和Ct值，根據(jù)2-ΔΔCt計算各基因的相對表達量，試驗重復3次。引物序列見表1，結(jié)果見圖6。

3 討論

乳腺癌發(fā)病率和死亡率逐年上升，2018年全球癌癥報告顯示其占新發(fā)女性癌癥的24.2%［1］。根據(jù)常規(guī)病理學分型，乳腺癌分為激素受體陽性、表皮生長因子受體2陽性和三陰性［5］3種類型。三陰性乳腺癌（TNBC）是指患者的雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和表皮生長因子受體2（HER2）均為陰性，具有復發(fā)率高、病死率高和侵襲性強的臨床特點［6］。本研究中采用的MDA-MB-231細胞即為TNBC細胞。目前，臨床對乳腺癌的治療多采取化療，其存在很大的耐藥性和復發(fā)性，預(yù)后極差。

有研究發(fā)現(xiàn)，顯齒蛇葡萄富含的AMP具有良好的抗癌（尤其對骨瘤、胃癌和乳腺癌）作用［7-9］。有研究證實，AMP可通過抑制乳腺癌細胞Akt／mTOR通路，誘導細胞死亡［10］；通過MAPK和PI3K／Akt信號傳導可促進高熱誘導的淋巴癌細胞凋亡［11］；可有效抑制乳腺癌荷瘤小鼠的腫瘤生長，且對模型小鼠的心、肝、腎功能均無明顯影響［12］；也有研究探討了AMP抑制腫瘤生長的可能機制，包括細胞周期阻滯、誘導細胞死亡和增加細胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生等信號通路［13］。

圖3 蛇葡萄素抗乳腺癌靶點GO富集分析和KEGG通路富集分析Fig.3 Go enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of the anti-breast cancer t argets of ampelopsin

圖4 MDA-MB-231細胞生長情況Fig.4 The proliferation of MDA-MB-231 cells

本研究中利用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法分析獲得AMP作用于乳腺癌相關(guān)靶基因共119個。通過PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出10個關(guān)鍵靶點，包括MMP2，SRC，PTPN11，HRAS等。進一步對核心靶點進行GO和KEGG通路富集分析，初步預(yù)測出AMP通過氧化應(yīng)激反應(yīng)等功能途徑及PI3KAkt信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路等多條通路途徑發(fā)揮治療乳腺癌的作用。此外，本研究中以MDA-MB-231細胞試驗加以驗證。結(jié)果表明，AMP作用MDA-MB-231細胞24 h能明顯抑制細胞的活力及遷移，同時抑制與增殖遷移相關(guān)的MMP2和SRC mRNA的表達。但本研究結(jié)果顯示，AMP對細胞遷移能力的抑制作用并非嚴格呈劑量依賴性，40μmol／L抑制能力強于60μmol／L，該現(xiàn)象與其他研究結(jié)果類似［14］，但具體機制還需進一步證實。

圖5 MDA-MB-231細胞遷移能力Fig.5 The migration ability of MDA-MB-231 cells

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

在關(guān)鍵靶點中，采用細胞試驗觀察了AMP對SRC的作用。SRC與細胞增殖、分化、存活和侵襲相關(guān)［15］。已有研究發(fā)現(xiàn)，其通過PI3K，MAPK，STAT3，F(xiàn)AK信號通路介導癌細胞生長、遷移和血管生成［16-17］。黏著斑激酶（FAK）是一種非受體酪氨酸激酶，F(xiàn)AK-SRC復合物在許多腫瘤細胞中被激活，F(xiàn)AK和SRC的催化活性在促進蛋白酶相關(guān)腫瘤轉(zhuǎn)移方面扮演著重要角色［18］。大量研究顯示，MMP尤其是MMP2和MMP9涉及腫瘤遷移環(huán)節(jié)［19］。有研究表明，AMP通過減少MMP2的表達來減弱增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變（PVR）的侵襲和遷移［20］；在肝癌細胞中，AMP也發(fā)揮了抑制肝癌細胞的遷移和侵襲作用［21］。在本研究中，AMP可顯著降低MDA-MB-231細胞的MMP2表達水平，提示MMP2可能是AMP抑制腫瘤細胞遷移的關(guān)鍵靶點。

圖6 MMP2和SRC mRNA表達情況Fig.6 The mRNA expression of MMP2 and SRC

綜上所述，AMP治療乳腺癌具有多成分、多靶點、多途徑的特點。本研究為AMP應(yīng)用于乳腺癌的防治提供了理論依據(jù)和研發(fā)思路。