趙秀婷，張燕潔，付 萌，李進偉，朱 松，范柳萍

（1.無限極（中國）有限公司，江門 529100；2.江南大學 食品學院，無錫 214122）

多糖（polysaccharide）是一類具有一定的重復單元和聚合度、相對分子量大小不一且呈一定分布寬度的生物大分子。其重復單元由相同或不相同的中性、酸性或堿性單糖以一定的摩爾比、糖苷鍵和分支度等連接而成，它們的極性一般較強，結(jié)構(gòu)相近，均呈多分散性，故不可能像小分子那樣可以高分辨、高選擇性地直接進行色譜分析[1]。為了改善其分離選擇性和提高檢測靈敏度，常將多糖水解后采用柱前或柱后衍生化色譜法進行分離檢測，其中 l-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化高效液相色譜法，因其具有溫和的反應條件和較高的靈敏度而被廣泛應用[2-5]。本研究將香菇多糖經(jīng)過微波輔助酸水解為單糖，研究 PMP衍生化-液相色譜法分析測定香菇多糖的單糖組成并進行方法學考察，并構(gòu)建香菇多糖的單糖組成PMP-HPLC指紋圖譜。

多糖具有多種生物活性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗氧化、降血脂、降血糖等，尤其是增強免疫力這一功能被廣泛關注[6-10]。多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關[11]，而多糖的水解產(chǎn)物可以側(cè)面表征多糖的一級結(jié)構(gòu)。因此，本研究擬采用香菇多糖的單糖組成PMP-HPLC標準指紋圖譜，并通過偏最小二乘回歸分析（PLS）建立多糖指紋圖譜及其免疫活性的譜效關系。進行多糖免疫活性與其單糖組成指紋圖譜的相關性研究，可以快速高效地表征多糖的免疫活性，并以指紋圖譜對活性的正相關峰指導實際生產(chǎn)從而獲得高活性多糖產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇多糖樣品（81批次）：無限極（中國）有限公司；三氟乙酸（TFA）、Na2HPO4、NaH2PO4、無水乙醇均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司；乙腈為色譜純：美國 TEDIA公司；12種單糖標準品為巖藻糖（Fuc）、鼠李糖（Rham）、氨基葡萄糖（GlcN）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、木糖（Xyl），氨基半乳糖（GalN）、核糖（Rib）、阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、半乳糖醛酸（GalUA）：美國Sigma-Aldrich公司。

小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7細胞）：上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所；DMEM培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司 Solarbio；二甲基亞砜（DMSO）：北京百靈威科技有限公司；新生牛血清（FBS）：美國Gibco-Invitrogen公司；青霉素–鏈霉素雙抗溶液：美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

Waters 2695高效液相色譜儀，配有Waters2489紫外檢測器、Empower色譜工作站：美國Waters公司；LE204E分析天平，感量0.000 1 g：梅特勒–托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；流動相真空抽濾脫氣裝置（津騰抽濾裝置1 L）：廣州奈姆塔貿(mào)易有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱、Multiskan GO型酶標儀、超低溫冰箱：美國 Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 香菇多糖樣品的制備

分別取10 mL香菇多糖樣品（81個批次），加入30 mL無水乙醇，充分搖勻后，4 000 r/min離心10 min，除去上清，沉淀用30 mL 80%乙醇溶解，充分混勻后再一次離心除上清，沉淀在60 ℃下烘干，備用。

1.3.2 香菇多糖樣品的微波水解

取20 mg香菇多糖放入微波消解管中，加入7 mL 3.0 mol/L的三氟乙酸溶液，130 ℃下微波水解30 min，得到香菇多糖水解液。

1.3.3 PMP衍生化

1.3.3.1 混合單糖標樣的衍生化 分別取100 μL的混合單糖標準液（各單糖質(zhì)量濃度均為0.36 g/L左右）與100 μL的0.6 mol/L NaOH溶液混合均勻；取50 μL的混合液與50 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液漩渦混勻；70 ℃反應100 min后冷卻至室溫；加50 μL 0.3 mol/L的HCl溶液進行中和；補水至1 mL，再加1 mL的氯仿，振搖混勻后靜置分層，棄去下層氯仿相，重復上述萃取步驟 3次以上，用0.45 μm微孔濾膜過濾后進行液相色譜分析。

1.3.3.2 香菇多糖水解樣品的衍生化 香菇多糖水解樣品的衍生化參考 Sun等的方法并稍作修改[12]，具體如下：取水解后的香菇多糖水解液200 μL于試管中，氮吹儀吹干，加1 mL水漩渦振蕩溶解。取100 μL上述溶液，與100 μL 0.6 mol/L的NaOH溶液混勻。加入0.5 mol/L的PMP甲醇溶液200 μL混勻。于70 ℃反應100 min后，冷卻至室溫。加250 μL 0.3 mol/L的HCl中和，然后加水（補 350 μL的水）至1 mL，混勻，再加 1 mL的氯仿，振搖混勻后靜置分層，棄去下層氯仿相，重復上述萃取步驟至少3次以上，用0.45 μm微孔濾膜過濾后進行液相色譜分析。

1.3.4 色譜條件

色譜柱為 ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.7）–乙睛（體積比為 80∶20）；柱溫：30 ℃；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：245 nm；流速：0.8 mL/min；進樣體積：10 μL。

1.3.5 PMP-HPLC方法學研究

1.3.5.1 系統(tǒng)適用性 將12種單糖混合標準品衍生化后，采用液相色譜條件分析，連續(xù)進樣5針，記錄色譜圖，計算各峰面積RSD（%）。

1.3.5.2 標準曲線、檢出限 精密稱取各單糖標樣適量，用水配置成系列標準溶液，采用液相色譜條件分析，以峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍。

1.3.5.3 重復性、穩(wěn)定性 平行制備水解多糖樣品溶液6份，采用液相色譜條件分別分析，計算6個樣品中各單糖峰面積的平均值及RSD（%）。取水解多糖樣品，分別在 0、2、4、6、8、12、24 h，采用液相色譜條件分析，計算樣品中各單糖峰面積的平均值及RSD（%）。

1.3.5.4 準確性 取已知單糖組成含量的多糖樣品，分別加入高、中、低3個濃度的混合單糖對照品溶液，微波水解法水解，采用液相色譜條件分析，測定其回收率及RSD（%）。

1.3.6 不同多糖溶液配制

準確稱取10 mg香菇多糖樣品，用含有1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基溶解后配成1 mg/mL的母液，在無菌條件下過0.22 μm微孔濾膜除菌，將濾液等梯度稀釋成500、250、100、50和25 μg/mL 5個劑量組。

1.3.7 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法測定RAW264.7細胞活力

MTT法測定RAW264.7細胞活力參考張勇的方法并稍作修改[13]，將處于對數(shù)生長期的RAW264.7小鼠巨噬細胞消化傳代并收集后接種于96孔板中，細胞密度為2×104個/mL，每孔接種量為 100 μL，同時在 96孔板的邊緣孔加入100 μL的PBS。將接種后的細胞搖勻后置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，每孔加入100 μg/mL的香菇多糖，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同時設置空白對照，之后向每孔加入10 μLMTT試劑（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸出上清液，并向每孔中加入150 μL DMSO溶液混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)15 min，在490 nm處用酶標儀測定吸光度值。細胞存活率計算公式為：

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準偏差表示，每個實驗至少重復三次。數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用SPSS 19.0軟件進行One-Way ANOVA分析，以及Tukey’s多重檢驗，P＜0.05被認為數(shù)據(jù)差異顯著。采用Origin軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與討論

2.1 PMP-HPLC方法學研究

2.1.1 系統(tǒng)適用性

由表 1可知，適用性實驗 RSD數(shù)據(jù)均滿足GB/T27417—2017《化學分析方法確認和驗證指南》附錄B要求，說明系統(tǒng)對不同單糖具有良好的適用性。在該色譜條件下，除木糖和阿拉伯糖外，其余10種單糖均能達到基線分離，理論板數(shù)以葡萄糖計不低于8 000，色譜圖見圖1。

表1 12種單糖對液相色譜的適用性Table 1 Applicability of 12 monosaccharides to liquid chromatography

圖1 衍生化處理的混合標樣（A）和香菇多糖（B）的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography (HPLC) of the derivatized mixed standard sample (A) and lentinan hydrolyzed samples (B)

2.1.2 標準曲線、檢出限

12種單糖的峰面積Y與其質(zhì)量濃度X (mg/L)在0.05～60 mg/L范圍內(nèi)具有很好的線性關系，線性系數(shù)均大于0.998 5，見表2。12種糖的檢出限（20 μL進樣，S/N=3）為0.12～0.35 mg/L。結(jié)果表明，該方法檢測線性很好，線性范圍較寬，檢測靈敏度很高。

表2 9種單糖的檢出限及線性關系Table 2 Detection limits and linear relationship of 9 monosaccharides

2.1.3 重復性、穩(wěn)定性

由表 3可知，重復性實驗 RSD數(shù)據(jù)均滿足GB/T27417—2017《化學分析方法確認和驗證指南》附錄B要求，說明該方法重復性好，可應用于香菇多糖水解樣品中10種單糖的分析。

表3 香菇多糖水解樣品的重復性實驗結(jié)果Table 3 Repetitive results of lentinan hydrolyzed samples

由表 4可知，穩(wěn)定性實驗 RSD數(shù)據(jù)均滿足GB/T27417—2017《化學分析方法確認和驗證指南》附錄B要求，說明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表4 香菇多糖水解樣品的穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 4 Stability results of lentinan hydrolyzed samples

2.1.4 準確性

各單糖在不同濃度下的回收率均在 78%～91%之間，RSD%均小于5.0%（表5），說明本方

法測定單糖含量回收率良好，準確度高。

表5 加標回收率和相對標準偏差Table 5 Recovery rate of standard addition and relative standard deviation %

2.2 香菇多糖PMP-HPLC標準指紋圖譜的構(gòu)建

2.2.1 香菇多糖PMP-HPLC標準指紋圖譜

將81個批次香菇多糖樣品的PMP-HPLC標準指紋圖譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成CDF格式，導入指紋圖譜專用軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，見圖 2。經(jīng)多點校正、峰匹配等軟件處理生成香菇多糖PMP-HPLC標準指紋圖譜，見圖3。

圖2 香菇多糖的PMP-HPLC圖譜Fig.2 PMP-HPLC chromatogram of lentinan

圖3 香菇多糖的PMP-HPLC標準指紋圖譜Fig.3 Standard fingerprint of lentinan chromatogram

2.2.2 單糖標準品對照定性共有峰中的單糖峰

選取自然界中常見的 12種單糖作為參照標準，來定性香菇多糖水解產(chǎn)物色譜分離圖譜中的各個單糖峰。配制單糖的混合標準溶液（各單糖的質(zhì)量濃度均為0.42 mg/mL左右）。將該混合標準溶液進行PMP衍生化后，進樣分析得到色譜圖（圖4A）。由圖可知，12種單糖的分離度較好，能夠滿足色譜指紋圖譜的定性要求。

按照相同的液相色譜條件，分析香菇多糖的指紋圖譜。對照12個單糖混合標樣色譜圖中各峰的相對保留時間，可以確定香菇多糖指紋共有特征峰中有7個是單糖峰，依次分別為甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖（圖 4B）。其單糖組成摩爾比為：甘露糖∶氨基葡萄糖∶核糖∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶巖藻糖=8∶1∶2∶155∶7∶1∶1。葡萄糖的摩爾百分比為 89%，半乳糖的摩爾百分比為 4%，甘露糖的摩爾百分比為5%。對81批次香菇多糖樣品進行相似度評價，均在0.94以上，說明各批次間相似度良好。

圖4 12種單糖標樣（A）和香菇多糖水解樣品（B）的PMP-HPLC圖譜Fig.4 PMP-HPLC spectra of 12 standard monosaccharides (A) and lentinan hydrolyzed samples (B)

Xu等從香菇子實體中分離得到一種雜多糖L2，由葡萄糖（87.5%）、半乳糖（9.6%）及阿拉伯糖（2.8%）組成[14]。Chen等從香菇子實體中分離得到三種香菇多糖 LEPA1，LEPB1和LEPC1，LEPA1的單糖組成摩爾比為果糖∶阿拉伯糖∶甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖=0.1∶0.1∶1.0∶1.2∶2.4；LEPB1和LEPC1均由甘露糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸組成，其摩爾比分別為 1.3∶3.7∶2.8∶1.6 和 0.7∶1.7∶3.1∶2.5[15]。Zhao等從香菇中分離得到多糖碎片 LEP1和LEP2，LEP1 僅由葡萄糖組成，而 LEP2的單糖組成摩爾比為甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖=5.9∶8.4∶88.7[16]。Jeff 等從香菇子實體中分離純化得到三種多糖，主要由葡萄糖組成，并含有少量的半乳糖和甘露糖[17]。Tian 等從巨型香菇中分離得到中性多糖LGPS-1，由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為3.0∶4.1∶7.1[18]。綜上所述，從香菇子實體和菌絲體中分離得到的多糖主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖組成，有的還可能含有少量的阿拉伯糖、木糖、果糖等[13]，與本研究結(jié)果相似。

2.3 香菇多糖PMP-HPLC指紋圖譜與其免疫活性的譜效關系

2.3.1 不同濃度香菇多糖溶液對RAW264.7細胞活力的影響

由表 6可知，香菇多糖溶液濃度在 25～100 μg/mL的范圍內(nèi)，其對細胞存活率的影響是隨著多糖溶液濃度的增大細胞存活率呈現(xiàn)升高的趨勢。然而，當采用高濃度香菇多糖溶液（500 μg/mL）處理細胞時，細胞存活率下降較為明顯，僅為58%，說明該濃度會抑制巨噬細胞生長。這一趨勢和鐵皮石解多糖對RAW264.7細胞的增殖活性影響相似[13]。多糖溶液濃度為100和200 μg/mL時，其對細胞存活率的影響基本一致。因此，選擇100 μg/mL香菇多糖溶液用于后續(xù)細胞實驗。

表6 不同濃度多糖溶液對RAW264.7細胞活力的影響Table 6 Effects of different concentrations of polysaccharides on RAW264.7 cell viability %

2.3.2 PMP-HPLC指紋圖譜與免疫活性相關性

RAW264.7小鼠巨噬細胞是一種免疫細胞，本研究選用該細胞模型來研究不同批次香菇多糖樣品對免疫細胞增殖的影響，從而初步探討多糖提取物的免疫調(diào)節(jié)活性。不同批次香菇多糖對RAW264.7細胞活力的影響如表 7所示，細胞存活率范圍為 136.76%～152.35%，說明香菇多糖可刺激免疫細胞的增殖。

表7 香菇多糖對RAW264.7細胞活力的影響Table 7 Effect of lentinan on the activity of RAW264.7 cells %

以指紋圖譜為基礎建立的多糖指紋圖譜譜效相關性研究，就是將“譜”中的多糖活性成分群的特征峰和化學成分的含量變化與“效”所代表的生理功效結(jié)果相對應，研究其中的規(guī)律，探索譜效相關性。將 16個香菇多糖樣品酸水解PMP-HPLC指紋圖譜的7個共有色譜峰面積百分比數(shù)據(jù)整理成矩陣，如表8所示。根據(jù)同一色譜條件下標準品的相對保留時間定性共有峰1到共有峰7分別為甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖。

表8 香菇多糖PMP-HPLC指紋圖譜峰數(shù)據(jù)矩陣Table 8 Peak data matrix of PMP-HPLC fingerprint of lentinan %

以指紋圖譜中共有峰的峰面積百分比為自變量X，多糖對RAW264.7細胞存活率為因變量Y，采用SPSS 26.0軟件進行偏最小二乘回歸分析，得到回歸方程為：

回歸系數(shù)如表 9所示，7個共有峰中，峰 1（甘露糖）、峰5（半乳糖）、峰6（木糖）和峰7（巖藻糖）是活性負相關峰，峰2（氨基葡萄糖）、峰3（核糖）和峰4（葡萄糖）為活性正相關峰，其對RAW264.7細胞存活作用的貢獻大小排序為峰2（氨基葡萄糖）＞峰3（核糖）＞峰4（葡萄糖）。有研究表明茶多糖中的甘露糖、鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖與其抗氧化活性密切相關，其中木糖和半乳糖其抗氧化能力呈負相關，而鼠李糖呈正相關[19]。此外，多糖的單糖組成也與抗腫瘤活性相關，通常含有葡萄糖多糖抗腫瘤活性較好，可能原因是在人類巨噬細胞中具有葡萄糖受體[20]。

表9 PLS分析結(jié)果Table 9 Analysis results of PLS

3 結(jié)論

本研究建立了一種柱前 PMP衍生化液相色譜測定香菇多糖單糖組成的方法，方法學研究表明該方法準確度高，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好，可應用于香菇多糖樣品的單糖組成分析。采用該方法對81批次香菇多糖樣品進行分析，構(gòu)建了基于多糖單糖組成信息的液相色譜指紋圖譜。為香菇多糖的質(zhì)量控制和活性測定提供更全面的參考。此外，以指紋圖譜為基礎，運用偏最小二乘回歸分析關聯(lián)香菇多糖單糖組成與RAW264.7細胞存活率，建立的多糖指紋圖譜譜效相關性研究，本研究將“譜”中的多糖活性成分群的特征峰與“效”所代表的生理功效結(jié)果相對應，研究其中的規(guī)律，初步探索香菇多糖的譜效相關性。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。